謝春霞，尹明芳，陶彩麗

（大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院糧食作物研究所，云南大理671005)

栽培生理

次氯酸鈉加吐溫80對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌比較試驗(yàn)

謝春霞，尹明芳*，陶彩麗

（大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院糧食作物研究所，云南大理671005)

升汞是滅菌效果非常好的一種滅菌劑，但它是有劇毒的重金屬鹽滅菌劑，對(duì)人畜有極強(qiáng)的毒性，且容易污染環(huán)境。為了尋找對(duì)馬鈴薯外植體安全有效的滅菌劑，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)馬鈴薯外植體，用次氯酸鈉溶液與添加吐溫80的次氯酸鈉溶液不同濃度、不同時(shí)間處理后，與升汞處理相比較成苗率、感染率和褐化率。試驗(yàn)結(jié)果表明，加2%吐溫80的11%次氯酸鈉溶液處理30 min，對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌效果最好，其成苗率高于0.1%升汞處理后的成苗率；加2%吐溫80的13%次氯酸鈉溶液處理20 min后的滅菌效果也較好，成苗率略低于0.1%升汞處理后的成苗率。

吐溫80；次氯酸鈉；馬鈴薯；外植體；滅菌

無(wú)菌外植體是組織培養(yǎng)成功的必要前提，從田間或溫室選取的植物材料，要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作接種到培養(yǎng)基上，才能進(jìn)入培養(yǎng)室保存。用于外植體表面滅菌的滅菌劑不僅要能有效殺死微生物，而且不能損傷植物組織，選取什么樣的滅菌劑及滅菌方法成為成功保存植物材料的關(guān)鍵。常用的滅菌劑有酒精、升汞、次氯酸鈉、漂白粉、雙氧水等[1]。李麗容等[2]用幾種滅菌劑對(duì)藍(lán)莓外植體進(jìn)行滅菌發(fā)現(xiàn)，70%酒精30 s+0.1%升汞6～8 min滅菌效果最好，其次是70%酒精30 s+2%次氯酸鈉8～10 min。莫良玉等[3]用不同滅菌劑組合對(duì)水稻、小麥和豆科綠豆等種子進(jìn)行滅菌，發(fā)現(xiàn)0.1%氯化汞滅菌效果最好，2%次氯酸鈉次之，10%雙氧水最差。于靜等[4]用酒精+不同濃度次氯酸鈉、氯化汞對(duì)積雪草進(jìn)行滅菌發(fā)現(xiàn)，75%酒精20 s+0.1%氯化汞6 min的滅菌效果最好，可達(dá)到86%的成活率。

升汞即氯化汞，其殺菌力極強(qiáng)，被用作滅菌劑已有100多年歷史，是被人們公認(rèn)的滅菌效果最好的一種滅菌劑，但升汞是有劇毒的重金屬鹽滅菌劑，對(duì)人畜有極強(qiáng)的毒性，操作不當(dāng)會(huì)對(duì)人體造成極大危害，且廢棄物難于處理，容易污染環(huán)境。而次氯酸鈉利用釋放出的活性氯離子殺死細(xì)菌，處理后能自然降解，對(duì)植物和人無(wú)害，不會(huì)造成環(huán)境污染，是一種較安全的表面滅菌劑。李志亮等[5]用次氯酸鈉對(duì)高羊茅種子進(jìn)行滅菌發(fā)現(xiàn)，用70%酒精30 s+50%次氯酸鈉20 min，即可達(dá)到滅菌目的。唐琳等[6]用0.1%升汞和3%～4%次氯酸鈉對(duì)番茄種子進(jìn)行滅菌發(fā)現(xiàn)，相較于0.1%升汞，番茄種子滅菌以3%～4%次氯酸鈉為佳。王丹等[7]用升汞和次氯酸鈉對(duì)亮葉忍冬外植體進(jìn)行滅菌發(fā)現(xiàn)，亮葉忍冬莖段最佳的滅菌藥劑是2%次氯酸鈉，處理15 min。袁源等[8]用幾種滅菌劑對(duì)青天葵感染組培材料進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，5%次氯酸鈉溶液滅菌10 min，不僅不會(huì)造成青天葵培養(yǎng)材料的損傷，還能較好的抑制污染。

表面活性劑具有固定的親水親油基團(tuán)，可消除表面滅菌劑與外植體的兩相界面，增加滅菌劑在外植體表面的附著性和沉積量，提高有效成分在水分條件下的釋放速度和擴(kuò)展面積，從而達(dá)到增加滅菌效果的作用。鄒永梅和黃雪方[9]對(duì)萬(wàn)壽菊外植體進(jìn)行滅菌發(fā)現(xiàn)，20%的84消毒液處理30 min與70%酒精30 min+0.15%氯化汞處理10 min的滅菌效果均較好，且84消毒液滅菌效果明顯好于次氯酸鈉溶液，雖然兩者有用成分都為次氯酸，但84消毒液中含有表面活性劑十二烷基磺酸鈉，所以能在較短時(shí)間內(nèi)殺滅細(xì)菌、病毒、細(xì)菌芽孢等。張瑞越等[10]用不同滅菌劑對(duì)油菜種子滅菌發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉、次氯酸鈣和雙氧水添加吐溫80后，其滅菌效果都明顯好于未添加吐溫80時(shí)的滅菌效果。所以在滅菌劑中添加適量表面活性劑可望提高滅菌劑的滅菌效果。吐溫80即聚山梨酯，是一種兩親型非離子型表面活性劑，能與水、甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯相混溶，因其具有較好的穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)上不易解離，不易受電解質(zhì)和pH的影響，毒性較小，所以在日常生活的諸多領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用[11]。

本試驗(yàn)通過(guò)用次氯酸鈉溶液和添加吐溫80的次氯酸鈉溶液，設(shè)置不同濃度、不同處理時(shí)間，對(duì)馬鈴薯外植體進(jìn)行表面滅菌，希望找到適于馬鈴薯外植體的安全有效的滅菌方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2014年6～7月在大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院糧食作物研究所組培室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 植物材料

本試驗(yàn)共3個(gè)馬鈴薯材料，分別為雜交后代‘10-2-8’、自交實(shí)生籽后代‘07.8.22’和‘07.8.18’，于3月份從田間收獲3個(gè)馬鈴薯材料的塊莖，置于室內(nèi)常溫下待其發(fā)芽，當(dāng)芽長(zhǎng)到1～1.5 cm時(shí)，取芽作為試驗(yàn)外植體材料。

1.2.2 滅菌劑

75%酒精，升汞溶液（0.1%氯化汞），11%次氯酸鈉溶液，13%次氯酸鈉溶液，11%次氯酸鈉溶液+2%吐溫80，13%次氯酸鈉溶液+2%吐溫80。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)處理

分別從3個(gè)馬鈴薯材料‘10-2-8’、‘07.8.22’、‘07.8.18’的塊莖上選取長(zhǎng)度1～1.5 cm的幼芽各12份，每份11～12個(gè)，分別放入小燒杯，在自來(lái)水上沖洗10 min，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)上備用。

1.3.2 滅菌處理

外植體的滅菌在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。滅菌處理分為兩個(gè)組：Ⅰ組和Ⅱ組，12個(gè)處理：處理1～12。Ⅰ組，75%酒精處理20 s后，分別用11%和13%次氯酸鈉溶液處理，處理時(shí)間為20,25,30 min，共6個(gè)處理，即處理1～6；Ⅱ組，75%酒精處理20 s后，分別用加2%吐溫80的11%和13%次氯酸鈉溶液處理，處理時(shí)間為20，25，30 min，共6個(gè)處理，即處理7～12。75%酒精處理后用無(wú)菌水沖洗3次，滅菌劑處理后用無(wú)菌水沖洗5次。

1.3.3 對(duì)照

分別從3個(gè)馬鈴薯材料的塊莖上選取長(zhǎng)度1～1.5 cm的幼芽各1份，每份11～12個(gè)，在自來(lái)水上沖洗10 min，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)上，75%酒精處理20 s，無(wú)菌水沖洗3次，0.1%氯化汞處理5 min，無(wú)菌水沖洗5次。

1.3.4 接種

將每個(gè)處理后材料剪去芽體根部，接種于MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種3瓶，每瓶培養(yǎng)基分散接種3個(gè)芽體。接種完畢，置于培養(yǎng)架上，弱光下保存。1周后統(tǒng)計(jì)成苗率、感染率、褐化率。

1.3.5 試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

分別將12個(gè)處理中每個(gè)處理的3個(gè)馬鈴薯材料的成苗外植體數(shù)、污染外植體數(shù)、褐化外植體數(shù)相加，計(jì)算出各個(gè)處理的平均成苗率、污染率、褐化率。

成苗率（%）=（成苗外植體總數(shù)∕接種外植體總數(shù)）×100

感染率（%）=（感染外植體總數(shù)∕接種外植體總數(shù)）×100

褐化率（%）=（褐化外植體總數(shù)∕接種外植體總數(shù)）×100

表1 不同處理的滅菌效果比較Table 1Comparison of sterilization effect of different treatments

2 結(jié)果與分析

2.1 吐溫80對(duì)馬鈴薯外植體滅菌效果的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅰ組（次氯酸鈉溶液）和Ⅱ組（加吐溫80的次氯酸鈉溶液）對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌效果存在一定差異，主要表現(xiàn)在成苗率、感染率、褐化率三個(gè)方面。由表1可以看出，濃度11%處理20，25，30 min和濃度13%處理20 min時(shí)，Ⅱ組馬鈴薯外植體的成苗率明顯好于Ⅰ組的成苗率；而濃度13%處理25和30 min時(shí)，Ⅱ組的成苗率低于Ⅰ組的成苗率。在濃度為11%、13%處理20，25，30 min時(shí)，Ⅱ組的感染率均明顯低于Ⅰ組的感染率。另外，濃度11%處理20和25 min，濃度13%處理20，25，30 min時(shí)，Ⅱ組的褐化率高于Ⅰ組的褐化率；濃度11%處理30 min時(shí)，兩者褐化率相同。

以上結(jié)果表明，Ⅱ組濃度11%處理20，25，30 min和濃度13%處理20 min的成苗率高于Ⅰ組；而在濃度13%處理25和30 min時(shí)，雖然污染率低于Ⅰ組，但褐化率明顯高于Ⅰ組，所以成苗率反而低于Ⅰ組。

2.2 不同濃度滅菌劑對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌效果

由表1可知，同一滅菌劑，不同濃度對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌效果存在一定差異。其中，Ⅰ組，處理20和25 min后，濃度13%處理時(shí)的成苗率高于濃度11%處理時(shí)的成苗率；而處理30 min后，由于13%處理時(shí)的褐化率高于11%處理時(shí)的褐化率，所以13%處理時(shí)的成苗率反而低于11%處理時(shí)的成苗率。Ⅱ組，處理20 min后，13%的成苗率高于11%的成苗率；而處理25和30 min后，雖然13%的感染率低于11%的感染率，但由于13%的褐化率高于11%的褐化率，所以13%的成苗率反而低于11%的成苗率。說(shuō)明用滅菌劑滅菌時(shí)，并不是濃度越高滅菌效果越好，而要考慮低濃度、長(zhǎng)時(shí)間和高濃度、短時(shí)間的組配。

2.3 不同滅菌時(shí)間對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌效果

由表1可知，同一滅菌劑、不同時(shí)間對(duì)馬鈴薯外植體滅菌效果存在一定差異。其中，Ⅰ組，濃度11%處理30 min的成苗率最高，而濃度13%時(shí)，處理25 min的成苗率最高。Ⅱ組，濃度11%處理30 min的成苗率最高，濃度13%時(shí)，處理20 min的成苗率最高，處理25和30 min時(shí)，處理時(shí)間越長(zhǎng)褐化率越高，成苗率反而越低。所以，在滅菌中選擇處理時(shí)間，不僅要能保證低污染率，還要避免處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的高褐化率。

2.4 與對(duì)照升汞的滅菌效果比較

由試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得出，對(duì)照升汞處理后的成苗率、感染率、褐化率分別為77.8%、3.7%、18.5%。由表1可知，12個(gè)處理中，濃度11%次氯酸鈉溶液+2%吐溫80處理30 min的成苗率最高為85.2%，其感染率、褐化率分別為11.1%、3.7%；濃度13%次氯酸鈉溶液+2%吐溫80處理20 min的成苗率次之為70.4%，其感染率、褐化率分別為7.4%、22.2%。與對(duì)照相比，濃度11%次氯酸鈉溶液+2%吐溫80處理30 min的成苗率高于對(duì)照，濃度13%次氯酸鈉溶液+2%吐溫80處理20 min的成苗率略低于對(duì)照。因此，在對(duì)馬鈴薯外植體進(jìn)行滅菌時(shí)，可以選擇加吐溫80的適宜濃度的次氯酸鈉溶液。

3 討論

升汞殺菌力強(qiáng)，是一種應(yīng)用較廣泛的殺菌劑，但因其是有劇毒的重金屬鹽殺菌劑，對(duì)人畜有極強(qiáng)的毒性，且不易降解，對(duì)環(huán)境容易造成嚴(yán)重污染，所以不適合作為首選的表面滅菌劑。大量研究[2,3,5-7]表明，次氯酸鈉是一種滅菌效果較好的表面滅菌劑，只要針對(duì)不同植物外植體，選取適宜的濃度和滅菌時(shí)間，就可能收到較好的滅菌效果。吐溫80即聚山梨酯，是一種非離子型表面活性劑，由本試驗(yàn)可知，它可以增加次氯酸鈉對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌效果，在次氯酸鈉對(duì)馬鈴薯外植體滅菌中可作為增效劑適量添加。

試驗(yàn)結(jié)果表明，加2%吐溫80的11%次氯酸鈉溶液處理30 min，對(duì)馬鈴薯外植體的滅菌效果最好，其成苗率高于0.1%升汞處理后的成苗率；加2%吐溫80的13%次氯酸鈉溶液處理20 min后的滅菌效果也較好，其成苗率略低于0.1%升汞處理后的成苗率。所以，在對(duì)馬鈴薯外植體進(jìn)行表面滅菌時(shí)，考慮到人畜安全和環(huán)境保護(hù)，可優(yōu)先選擇加吐溫80的次氯酸鈉溶液。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，由于次氯酸鈉溶液極不穩(wěn)定，易分解，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，次氯酸鈉溶液中的有效氯含量逐漸減少，造成次氯酸鈉溶液對(duì)馬鈴薯外植體的表面滅菌效果大打折扣，所以在用次氯酸鈉溶液進(jìn)行外植體表面滅菌時(shí)，最好現(xiàn)用現(xiàn)配，且注意低溫避光保存。

[1]盧翠華,邸宏,張麗莉.馬鈴薯組織培養(yǎng)原理與技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2009.

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Comparative Trial of Sterilizing Potato Explant with Sodium Hypochlorite Added with Tween 80

XIE Chunxia,YIN Mingfang＊,TAO Caili
(Dali Institute of Agricultural Sciences and Extension,Institute of Food Crops,Dali,Yunnan 671005,China)

Mercuric chloride is one of the good explant sterilants,but it is poisonous to human beings and animals and contaminates environments due to its heavy metal salt.In order to find a safe and an effective potato explant sterilant,this experiment compared mercuric chloride,sodium hypochlorite and sodium hypochlorite added with Tween 80 in different concentrations and different sterilization time for seedling rate,contamination rate and browning rate of potato explants.The results showed that potato explants treated with 11%sodium hypochlorite added with 2%Tween 80 for 30 min gave higher seedling rate than 0.1%mercuric chloride;13%sodium hypochlorite added with 2%Tween 80 treatment for 20 min also gave acceptableresultsthoughtheseedlingratewasslightlylowerthanthat of thecontrol.

Tween 80;sodium hypochlorite;potato;explant;sterilization

S532

B

1672－3635（2014）05-0273-04

2014-07-24

大理州脫毒馬鈴薯良種繁育基地建設(shè)項(xiàng)目。

謝春霞（1984-），女，農(nóng)藝師，碩士，主要從事馬鈴薯育種和組培研究。

尹明芳，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事馬鈴薯育種與栽培技術(shù)研究，E-mail:chunxiaxie9@163.com。