王 麗，丁圣剛，李忠強，王亞亭

stim1和orai1蛋白在哮喘大鼠支氣管平滑肌中的表達

王 麗1，丁圣剛1，李忠強2，王亞亭1

目的研究基質(zhì)交感分子1（stim1）和鈣離子釋放激活鈣離子通道蛋白1（orai1）在哮喘氣道平滑肌細胞中表達水平的變化。方法選取40只清潔級SD大鼠隨機分為對照組和哮喘組，其中哮喘組用雞卵清蛋白（OVA）激發(fā)制備大鼠哮喘模型（n＝20），對照組用生理鹽水代替（n＝20）。肺組織病理切片HE染色判斷哮喘模型是否建立成功，分析支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的細胞總數(shù)及分類計數(shù)，應(yīng)用免疫組化技術(shù)及彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定stim1和orai1蛋白陽性細胞平均光密度值。結(jié)果肺組織病理切片HE染色鏡下觀察呈現(xiàn)大量炎細胞浸潤，支氣管黏膜腫脹，支氣管腔內(nèi)可見黏液栓等，證實哮喘模型建立成功。哮喘組中大鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞計數(shù)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。哮喘組大鼠支氣管平滑肌表達orai1蛋白陽性細胞平均光密度值明顯高于對照組（P＜0.05）。哮喘組和對照組大鼠支氣管平滑肌表達stim1蛋白陽性細胞的平均光密度值無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論orai1蛋白在哮喘大鼠氣道平滑肌細胞中表達變化較stim1蛋白明顯，對支氣管平滑肌調(diào)節(jié)作用可能更重要。

基質(zhì)交感分子1；orai1蛋白；哮喘；平滑肌細胞

鈣庫調(diào)控鈣離子內(nèi)流（store operated calcium entry，SOCE）在機體生理、病理活動中起著重要作用，參與細胞的生長、遷移、增殖與分化，同時與機體免疫細胞、炎癥細胞以及結(jié)構(gòu)細胞發(fā)揮作用有密切關(guān)系［1－2］。鈣離子釋放激活鈣離子通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel protein 1，orai1）和基質(zhì)交感分子1（stromal interaction molecule l，stim1）是構(gòu)成SOCE的重要分子，orai1被公認為介導(dǎo)SOCE通道中Ca2＋內(nèi)流的離子通道，stim1被認為是胞內(nèi)鈣庫Ca2＋的“傳感器”，Ca2＋敏感區(qū)是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）腔內(nèi)的EF-hand結(jié)構(gòu)。支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展與機體慢性炎癥和長期免疫應(yīng)答反應(yīng)有密切關(guān)系。該研究旨在探討orai1蛋白在哮喘大鼠氣道平滑肌細胞中表達變化，以期證實構(gòu)成SOCE的orai1和stim1與支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展存在的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠40只，清潔級，雄性，體重100～130 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑與儀器雞卵清蛋白（OVA）購自美國Sigma公司；氫氧化鋁粉購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；orai1和stim1一抗抗體購自美國Abcam公司；羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠哮喘模型的建立 參照文獻［3］方法，取清潔級SD大鼠40只，隨機分為對照組和哮喘組。哮喘組于第1、8、15天分別腹腔注射10%OVA溶液1 ml（含100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁）進行致敏，對照組用生理鹽水代替腹腔注射；哮喘組于第16天起霧化吸入含有1%OVA生理鹽水1 ml，每次30 min，共7 d，激發(fā)哮喘，使其出現(xiàn)打噴嚏、喘息、呼吸急促或呼吸困難等表現(xiàn)；對照組用生理鹽水代替霧化吸入，吸入時間相同。

1.3.2 標本的留取 最后一次霧化吸入后24h內(nèi)，用3%戊巴比妥（0.3 ml/100 g）腹腔注射進行麻醉，麻醉后行開胸手術(shù)，分離周圍組織，充分暴露左右主支氣管，結(jié)扎右肺主支氣管，并切取右肺葉，置于裝有4%多聚甲醛溶液中充分浸末備用。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的留取 左肺予以生理鹽水3 ml灌洗，重復(fù)進行3次，每次灌洗時間持續(xù)30 s，將回抽的灌洗液放入離心管，經(jīng)4℃1 000 r/min離心10 min，離心后棄去上清液，將沉淀細胞用Hanks液洗滌離心2次，棄去上清液，加入Hanks液吹打混勻制成細胞懸液，細胞懸液涂片經(jīng)HE染色后用改良牛氏血細胞計數(shù)板做細胞計數(shù)。

1.3.4 石蠟切片HE染色 將浸入4%甲醛溶液固定的新鮮肺組織，24h后制作蠟塊，后用切片機連續(xù)切片，厚度為5 μm。常規(guī)用脫蠟、乙醇梯度脫水，行HE染色，光鏡下觀察肺臟組織病變情況。

1.3.5 石蠟切片免疫組化 將肺組織切片放在90℃恒溫箱中烘烤10 min后，常規(guī)用脫蠟、乙醇梯度脫水，PBS沖洗后分別應(yīng)用orai1和stim1蛋白免疫組化試劑盒，羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體作為標記二抗，依次按步驟選取比較完整的支氣管，顯微鏡下觀察計數(shù)表達orai1和stim1蛋白的陽性細胞，并隨機選取5個高倍視野，進行彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定orai1和stim1蛋白陽性細胞平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺部組織形態(tài)學(xué)觀察行HE染色后，鏡下觀察哮喘組大鼠肺臟組織，表現(xiàn)為支氣管黏膜腫脹，內(nèi)膜皺襞增多，部分上皮細胞破壞、脫落，杯狀細胞增生，平滑肌層增厚，管壁增厚，管腔狹窄，黏液分泌增多，可見黏液栓形成，管壁周圍見大量炎癥細胞浸潤；對照組則未見上述炎性改變，僅有少許炎癥細胞浸潤，支氣管腔內(nèi)少許分泌物。見圖1。

圖1 兩組大鼠肺部組織表達 HE×200

2.2 支氣管BALF涂片HE染色細胞計數(shù)兩組大鼠BALF中均含有中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等，與對照組比較，哮喘組大鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞計數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠BALF中細胞計數(shù)及分類（n＝20，±s）

表1 兩組大鼠BALF中細胞計數(shù)及分類（n＝20，±s）

項目哮喘組對照組t值P值細胞總數(shù)（×106/L）110.70±27.5650.00±19.77 0.581 0.000中性粒細胞（×106/L）28.80±5.075.50±2.643.403 0.000嗜酸性粒細胞（×106/L）7.80±2.251.60±1.084.033 0.000

2.3 支氣管平滑肌orail和stim1表達與對照組相比，哮喘組大鼠支氣管平滑肌細胞及其周圍組織均有orai1蛋白陽性細胞表達，呈棕黃色顆粒，支氣管平滑肌細胞平均光密度值明顯升高（0.099±0.025 vs 0.072±0.014，P＜0.05）；哮喘組大鼠支氣管平滑肌細胞及其周圍組織均有stim1蛋白陽性細胞的表達，呈棕黃色顆粒，支氣管平滑肌細胞的平均光密度值與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.093 ±0.025 vs 0.088±0.017，P＞0.05）。見圖2。

圖2 orai1、stim1蛋白免疫組化檢測

3 討論

氣道平滑肌細胞是哮喘發(fā)作時氣道結(jié)構(gòu)變化的主要效應(yīng)細胞，被認為是氣道高反應(yīng)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、氣道上皮細胞等多種細胞和細胞組分也參與哮喘的慢性炎癥反應(yīng)。Baryshnikov et al［4］利用siRNA法敲除大鼠血管平滑肌細胞及人主動脈血管平滑肌細胞中的stim1和（或）orai1蛋白降低細胞的SOCE活性，明顯抑制平滑肌細胞的增殖及細胞外Ca2＋內(nèi)流，進而使中性粒細胞的炎癥反應(yīng)活性降低，肥大細胞脫顆粒及釋放炎癥介質(zhì)減少，淋巴細胞克隆分化減弱［5－8］。

有研究［9］表明orai1和stim1兩種蛋白是構(gòu)成SOCE通路的重要組成部分，在細胞靜息狀態(tài)下stim1和orai1蛋白分別均勻地分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細胞膜上，胞外激動劑作用于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-linked receptor，GPCR）活化磷脂酶C（phospholipaseC，PLC）產(chǎn)生三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），IP3與細胞內(nèi)鈣庫IP3受體（IP3 receptor， IP3R）結(jié)合，使鈣庫開放，鈣庫迅速釋放Ca2＋流入胞質(zhì)，并出現(xiàn)鈣庫損耗狀態(tài)，stim1蛋白感受鈣庫的充盈狀態(tài)，stim1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上重新排列，在靠近細胞膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上聚集［10－11］，將細胞內(nèi)鈣庫耗竭信號，傳遞給位于細胞膜上的orai1蛋白，orai1蛋白活化且表達增多，形成功能性鈣離子通道，促使胞外Ca2＋內(nèi)流。

哺乳動物細胞中還有兩個orai1的同源蛋白：orai2、orai3，在HEK293細胞研究［12］顯示所有的orai蛋白都能增加SOCE，其中orai1功效最強，且是構(gòu)成SOCE通道的重要組成部分，介導(dǎo)Ca2＋的內(nèi)流。本研究結(jié)果顯示哮喘組支氣管平滑肌細胞內(nèi)表達orai1蛋白的陽性細胞平均光密度值明顯高于對照組，提示在哮喘發(fā)作時，氣道平滑肌細胞經(jīng)過G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使鈣庫開放，并出現(xiàn)鈣庫耗竭，stim1作為胞內(nèi)鈣庫Ca2＋的“傳感器”，介導(dǎo)Ca2＋內(nèi)流的離子通道開放，胞外Ca2＋流入胞內(nèi)，填充胞內(nèi)鈣庫，以維持氣道平滑肌細胞內(nèi)外鈣離子平衡及其收縮功能。利用RNA干擾技術(shù)沉默orail蛋白后可顯著抑制毒胡蘿卜素或環(huán)匹阿尼酸清空鈣庫引起的Ca2＋內(nèi)流，從而抑制平滑肌Ca2＋內(nèi)流，充分證實這一觀點［9］。

stim1被證明是細胞內(nèi)Ca2＋的傳感器，檢測細胞內(nèi)Ca2＋含量。目前已發(fā)現(xiàn)stim分子有stim1和stim2兩種亞型［13－14］。stim1在SOCE通道活性中有重要作用，鈣庫排空之前stim1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，隨胞內(nèi)鈣庫排空，stim1在靠近細胞膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上以“斑”狀重新聚集［14－15］，Ca2＋敏感區(qū)EF-hand結(jié)構(gòu)域的基因突變，可能會降低其與Ca2＋的親和力，使stim1蛋白對未排空的鈣庫敏感，導(dǎo)致SOC非鈣庫調(diào)控的激活［4］。本研究結(jié)果顯示哮喘組支氣管平滑肌細胞表達stim1蛋白陽性細胞平均光密度值與對照組比較無明顯差異，然而Potier et al［1］在研究細胞生長過程中發(fā)現(xiàn)，在哮喘大鼠的氣道平滑肌細胞中stim1的表達較對照組大鼠的表達增多，所以stim1蛋白在氣道平滑肌細胞中作用機制仍需進一步探討。

綜上所述，stim1和orai1蛋白作為SOCE通路的重要組成部分，在哮喘氣道平滑肌細胞中表達水平的變化，可能對氣道平滑肌收縮功能起到重要作用，且orai1蛋白對支氣管平滑肌調(diào)節(jié)作用更重要，SOCE通道可能參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展，其作用機制仍需進一步研究。

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The expression of stim1 and orai1 protein in asthmatic rats airway smooth muscle cells

Wang Li1，Ding Shenggang1，Li Zhongqiang2，et al
（1Dept of Pediatrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Pediatrics，Linyi City People′s Hospital，Linyi 276000）

ObjectiveTo investigate the changes of stim1 and orai1 protein in the level of expression in asthmatic airway smooth muscle cells.Methods40 SD rats were randomly divided into normal control group and asthma group，and asthma model was established by OVA sensitization in rats.HE staining of lung tissue to determine whether the asthma model successfully established.Cell counting and classification were obtained in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of rats，immunohistochemical detection and color graphic analysis system was used to measure the expression of stim1 and orai1 protein positive cells mean optical density value.ResultsThe lung tissue pathological section HE staining showed inflammatory cell infiltration，bronchial mucosal edema，bronchial visible mucus，confirmed the asthma model was established successfully.Compared with the normal control group，the total number of cells，neutrophils count，eosinophils count in BALF sediment of the asthma group were significantly increased，and the difference was statistically significant（P＜0.01）.The expression of orai1 protein positive cells mean optical density value of asthma group was significantlyhigher than the normal control group（P＜0.05）.Asthma group and normal control grouphad no significant difference in expression the stim1 protein positive cells in the average optical density value（P＞0.05）.ConclusionOrai1 proteins may play an important role in the contraction of asthma rat airway smooth muscle cells.

stim1；orai1；asthma；airway smooth muscle cells

R 562.25

A

1000－1492（2014）04－0430－04

2013－10－28接收

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

2臨沂市人民醫(yī)院兒科，臨沂 276000

王 麗，女，碩士研究生；王亞亭，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：wangyating1348＠126.com