武 娟，趙玉然，唐慶娟,，王靜鳳，王玉明，李兆杰，薛 勇，薛長(zhǎng)湖

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.山東省出入境檢驗(yàn)檢疫局食品與農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)機(jī)構(gòu)，山東 青島 266003）

諾如病毒（Norovirus，NV）是目前最為常見的食源性病毒之一，是一種單鏈RNA病毒。流行病學(xué)調(diào)查提示牡蠣等雙殼貝類是諾如病毒最主要的食物性傳播載體[1]。到目前為止，全世界范圍內(nèi)已報(bào)道了數(shù)十起食用諾如病毒污染的牡蠣導(dǎo)致的流行性腹瀉爆發(fā)事件，嚴(yán)重影響了牡蠣的食品安全性[2-7]。近年來，不少國(guó)家要求進(jìn)口的凍貝產(chǎn)品不得攜帶諾如病毒。我國(guó)的貝類產(chǎn)量居世界首位，建立適用于大規(guī)模貝類中諾如病毒快速檢測(cè)的新方法意義重大。

目前，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)是國(guó)內(nèi)檢測(cè)諾如病毒最主要的手段[8]。但是該技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備和檢測(cè)者的技能均有較高要求，在基層單位很難推廣，而且所需時(shí)間較長(zhǎng)，難以滿足貝類產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。另外一種常用方法是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。國(guó)內(nèi)外研究者利用基因工程方法獲得多種基因型的諾如病毒衣殼蛋白或合成肽，聯(lián)合免疫動(dòng)物后獲得特異性免疫血清，建立了商品化的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒[9-11]。由于該方法成本較高，導(dǎo)致試劑盒價(jià)格昂貴，不適合在價(jià)格相對(duì)低廉的貝類產(chǎn)品檢測(cè)中推廣。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中利用大腸桿菌系統(tǒng)原核表達(dá)了GⅡ-4型諾如病毒衣殼蛋白，表達(dá)和純化的流程相對(duì)簡(jiǎn)單且操作容易，成本較低[12]。本研究擬利用原核表達(dá)的諾如病毒重組衣殼蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立相應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法，為實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中諾如病毒的快速檢測(cè)目標(biāo)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾如病毒衣殼蛋白由本實(shí)驗(yàn)室通過大腸桿菌表達(dá)NV GⅡ-4型衣殼蛋白基因獲得[12]。非細(xì)菌性腹瀉病人糞便樣品由青島市兒童醫(yī)院提供。

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國(guó)Sigma公司；TMB底物 加拿大Bio Basic公司；HRP-羊抗兔IgG北京博奧森生物技術(shù)有限公司；吐溫-20 青島碧海生物試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自上海Sangon公司。

1.2 儀器與設(shè)備

島津UV2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；96孔12道可拆聚苯乙烯酶標(biāo)板 青島碧海生物試劑有限公司；CliniBio 128C酶標(biāo)儀 奧地利ASYSHitech有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物免疫與NV抗血清的制備

將原核表達(dá)的諾如病毒衣殼蛋白，免疫新西蘭大白兔。采用背部4點(diǎn)注射免疫，第1次每只注射2 mg/mL抗原，免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合乳化；2、3、4次免疫每只注射1 mg/mL抗原，用弗氏不完全佐劑乳化注射家兔；第5次直接注射蛋白溶液1 mg/mL。每次免疫相隔14 d。第5次免疫前，耳靜脈采血，間接ELISA方法測(cè)定效價(jià)。第5次免疫后7 d，頸動(dòng)脈放血，分離血清，-20 ℃凍存。

1.3.2 諾如病毒抗血清效價(jià)的ELISA檢測(cè)

將諾如病毒衣殼蛋白溶液透析24 h之后真空凍干24 h，稱質(zhì)量后溶于5 mg/mL碳酸鹽緩沖溶液（carbonate buffer solution，CBS）中用作包被抗原。包被抗原和抗體最佳濃度的測(cè)定用抗原包被96孔板，按方陣滴定法測(cè)定包被抗原和抗血清反應(yīng)的最佳工作濃度，測(cè)定OD450nm值。根據(jù)曲線圖，選擇OD450nm值在1.0左右的抗原包被物濃度和酶標(biāo)抗體的稀釋度為最適工作濃度。

ELISA操作參照文獻(xiàn)[12]步驟如下：1）NV衣殼蛋白稀釋至20 μg/mL包被96孔板，4 ℃過夜，洗板；2）封閉液（1×PBST，0.5%牛血清白蛋白）封閉，37 ℃作用1 h，洗板；3）NV抗血清用pH 7.4、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphat buffered saline，PBS）按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶12 000、1∶14 000的比例稀釋后，加入待測(cè)樣品孔，空白孔加pH 7.4、0.01 mol/L的PBS緩沖液，陰性對(duì)照孔加免疫前采集的兔血清，37 ℃作用1 h，洗板；4）加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）底物溶液顯色，測(cè)定OD450nm值，通過Excel軟件作圖并計(jì)算各種稀釋度下的P/N值，以P/N值大于2.0者為陽性，P/N值接近2.0的抗血清稀釋度為該抗體效價(jià)。

1.3.3 諾如病毒ELISA法與PCR法的比較

取經(jīng)RT-PCR方法（采用引物P289/290[13]）驗(yàn)證為諾如病毒GⅡ型陽性的糞便樣品4份，其中3株為諾如病毒GⅡ-4型，1株為諾如病毒GⅡ-3型，陰性樣品2份，作為包被蛋白進(jìn)行包被，用諾如病毒抗血清對(duì)其進(jìn)行ELISA檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用4個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組1與對(duì)照組2為2份陰性樣品包被抗原，對(duì)照組3與對(duì)照組4為2份陽性樣品包被抗原，對(duì)照組1與對(duì)照組3添加陰性血清，對(duì)照組2與對(duì)照組4添加陽性血清，血清均按照1∶1 000進(jìn)行稀釋，空白組添加PBS。通過每個(gè)對(duì)照組之間的反應(yīng)，驗(yàn)證抗血清對(duì)陽性樣品的檢測(cè)能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗血清效價(jià)的ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖1 抗血清效價(jià)的測(cè)定Fig.1 Determination of antiserum titer

用間接ELISA方法測(cè)得抗血清效價(jià)，如圖1所示，所制備的兔抗NV衣殼蛋白效價(jià)可達(dá)到1∶10 000，可以滿足免疫檢測(cè)的要求。

2.2 ELISA法與PCR法對(duì)諾如病毒檢測(cè)的結(jié)果比較

通過4個(gè)對(duì)照組的抗原抗體反應(yīng)，測(cè)定OD450nm，并計(jì)算各種對(duì)照組條件下的P/N值，結(jié)果見表1，只有陽性樣品與陽性血清反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)陽性，其余為陰性。在所檢測(cè)的糞便樣品中，4份經(jīng)PCR檢測(cè)為NV GⅡ型陽性的糞便樣品中，僅1份樣品可通過ELISA方法檢測(cè)為陽性樣品，P/N為2.0。而其余3份經(jīng)PCR驗(yàn)證為NV陽性的糞便樣品，P/N均小于2.0，檢測(cè)結(jié)果為陰性。這說明本實(shí)驗(yàn)所得的抗血清特異性比較好，其檢測(cè)范圍亦較窄。因此，在此抗體基礎(chǔ)上的ELISA方法檢測(cè)實(shí)際糞便樣品時(shí)，其檢出率較PCR方法低。

表1 ELISA法與PCR法對(duì)諾如病毒4個(gè)對(duì)照組P/N檢測(cè)結(jié)果的比較Table 1 Comparison of P/N results of four control groups detected by ELISA and PCR

通過ELISA檢測(cè)方法與PCR檢測(cè)方法初步比較，可以看出ELISA檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際糞便樣品的檢出率較PCR方法低，這與Jiang等[9]通過VLPs制備的諾如病毒單抗對(duì)實(shí)際糞便樣品的檢測(cè)率非常低的報(bào)道相一致。推測(cè)其中原因可能是由于糞便樣品中雜蛋白的干擾，或病毒濃度過低所致，且NV變異性強(qiáng)，一種遺傳組型抗體不能識(shí)別其他組型抗原，對(duì)自身遺傳組型抗原的識(shí)別也因衣殼蛋白的差異性受到限制，且檢出率相對(duì)較低。同時(shí)，由于PCR檢測(cè)NV病毒時(shí)，病毒是經(jīng)過提純的，相對(duì)濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實(shí)際糞便樣品。PCR檢測(cè)結(jié)果與NV特異探針雜交結(jié)果的比較以及PCR陽性與被檢者感染NV的一致性都顯示用RT-PCR方法具有很高的靈敏度[13]，因此不能簡(jiǎn)單地將PCR檢測(cè)方法與ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行比較。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，用ELISA法檢測(cè)水產(chǎn)品中諾如病毒時(shí)，首先需要對(duì)病毒進(jìn)行濃縮提純。

3 討 論

NV GII-4型是我國(guó)諾如病毒主要流行株之一[14-15]，但目前還沒有關(guān)于NV GⅡ-4型抗血清的報(bào)道。1992年，Jiang等[9]用重組桿狀病毒表達(dá)了NV衣殼蛋白（rNV），rNV在昆蟲細(xì)胞中自動(dòng)組裝成病毒樣顆粒（virus like particals，VLPs），此方法可以大量獲得與病毒形態(tài)和抗原性相似的VLPs。但根據(jù)2000年Yoda等[16]對(duì)NV衣殼蛋白抗原表位的研究表明，NV衣殼蛋白的保守區(qū)域位于N末端，在VLPs中比較保守的N端被包裹在內(nèi)，而變易比較大的C端暴露在外，因此免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體也是主要針對(duì)病毒衣殼蛋白C端抗原，這樣就限制了抗體識(shí)別其他型病毒的能力，而原核表達(dá)的可融性的衣殼蛋白，N端和C端的抗原表位均很好的暴露，免疫動(dòng)物得到的抗體可以識(shí)別衣殼蛋白的各區(qū)，因此通過原核表達(dá)NV衣殼蛋白而獲得的多克隆抗體將具有更廣泛的檢測(cè)范圍。2001—2003年Yoda等[10-11]又通過原核表達(dá)的衣殼蛋白制備了單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)GⅡ衣殼蛋白制備的單抗其抗原表位可以很好的識(shí)別GⅠ、GⅡ型的NV衣殼蛋白N端40個(gè)氨基酸，它們的抗原表位來自于N末端暴露在外的氨基酸（QQNIIDPWIMN）肽。更加表明原核表達(dá)的NV衣殼蛋白具有不可替代的優(yōu)越性。本實(shí)驗(yàn)室采用Yoda等[10-11]提出的諾如病毒原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)諾如病毒衣殼蛋白，制備多抗。通過DNAtools的分析，不存在終止密碼子突變，該衣殼蛋白基因能夠完整的被翻譯。在該蛋白質(zhì)序列中存在Yoda等[10-12]提出的N末端11個(gè)保守氨基酸（QQNIIDPWIMN），該11個(gè)保守氨基酸位于諾如病毒衣殼蛋白抗原表位，以此蛋白免疫動(dòng)物獲得的抗血清，理論上比通過VLPs免疫獲得的抗血清具有更廣的檢測(cè)范圍。

由于多抗的制備具有抗原制備快，耗時(shí)短，操作安全，成本低廉，制備難度低的特點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上開發(fā)試劑盒有經(jīng)濟(jì)適用的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于大量、低廉水產(chǎn)品（如牡蠣）的檢測(cè)有著單抗不可代替的優(yōu)越性[12]。在我國(guó)，針對(duì)諾如病毒食品檢測(cè)方面的應(yīng)用，制備NV多抗還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA方法，方法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。多抗相對(duì)于單抗，更容易捕捉抗原，因?yàn)楹锌共煌砦坏目贵w，此外通過大腸桿菌表達(dá)的衣殼蛋白抗原表位又全部展露在外，以此制備的多克隆抗體相對(duì)于VLPs將具有更廣泛的識(shí)別范圍，在一定程度上可以減少試劑盒制備過程中需要表達(dá)病毒株的基因組型[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)制備了NV衣殼蛋白的多抗，以期能獲得成本低廉且檢測(cè)范圍廣的高效酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。通過將大腸桿菌表達(dá)的諾如病毒衣殼蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得諾如病毒抗血清，并通過間接ELISA方法對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該抗血清效價(jià)可達(dá)到1∶10 000，能夠滿足免疫檢測(cè)的要求。目前所用ELISA檢測(cè)間接法一般標(biāo)本用量為5～10μL，在檢測(cè)孔中作10～20倍稀釋，之所以作高比例的稀釋，主要是受間接法固有的缺點(diǎn)限制，因?yàn)槿绻鍧舛冗^高，血清中存在的大量免疫球蛋白對(duì)酶標(biāo)板的非特異吸附會(huì)造成陰性標(biāo)本本底很高，無法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效判斷。在ELISA檢測(cè)中，用樣品稀釋液調(diào)整反應(yīng)成分的濃度，調(diào)節(jié)適宜的OD值范圍，為免疫反應(yīng)提供適宜的環(huán)境，降低非特異吸附，抑制非特異反應(yīng)等，提高特異性反應(yīng)和檢測(cè)的靈敏度，提高免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的可行性，以獲得正確的結(jié)果。因此，ELISA檢測(cè)方法的條件優(yōu)化及方法學(xué)評(píng)價(jià)是至關(guān)重要的。

本實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測(cè)方法與PCR檢測(cè)方法初步比較，得出ELISA檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際糞便樣品的檢出率較PCR方法低，提示ELISA法檢測(cè)水產(chǎn)品中諾如病毒時(shí)，需對(duì)病毒進(jìn)行濃縮提純。吳斌等[17]通過用熒光定量PCR法和ELISA法檢測(cè)貝類中的諾如病毒，得出這兩種方法都可以用于快速檢測(cè)諾如病毒，但ELISA法更適于檢測(cè)諾如病毒含量低的樣品。然而由于諾如病毒的基因型的多樣性和復(fù)雜性，設(shè)計(jì)出具有特異性和廣泛適用性的引物已成為RT-PCR檢測(cè)的關(guān)鍵。各國(guó)實(shí)驗(yàn)室大多是以O(shè)RF1編碼病毒RNA多聚酶上的保守區(qū)段為靶序列來設(shè)計(jì)引物，但這種方法不具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，研究者們致力于尋找檢測(cè)能力較好的引物。對(duì)諾如病毒的PCR擴(kuò)增，首先要提取諾如病毒的RNA，RNA非常不穩(wěn)定，暴露在空氣中很容易降解，糞便樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪、金屬離子等都是能夠抑制反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶活性的物質(zhì)，因此在進(jìn)行RT-PCR之前有必要對(duì)病毒核酸進(jìn)行高效率的提取純化。雖然PCR檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好，但是該方法并不適合大量產(chǎn)品短時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)，仍然需要繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作與成本較高的測(cè)序過程，因此建立NV的ELISA檢測(cè)試劑盒還是有其必要性的。

由于NV病毒具有較強(qiáng)的變異性，同一遺傳組型不同病毒株在衣殼蛋白區(qū)域可能存在較大差異，在實(shí)際檢測(cè)過程中抗體病毒株型與實(shí)際傳播的病毒株型也可能存在較大的差距，因此后期本實(shí)驗(yàn)難以找到合適的糞便樣品以進(jìn)行抗血清特異性的進(jìn)一步研究，這就增加了諾如病毒檢測(cè)的難度[16]。雖然原核表達(dá)的衣殼蛋白制備的抗血清理論上檢測(cè)范圍較VLPs制備的抗血清檢測(cè)范圍廣，但是諾如病毒多抗檢測(cè)試劑盒的研制還需要針對(duì)我國(guó)流行的GGⅡ3、GGⅡ1和GGⅡ7型病毒衣殼蛋白多抗的獲得，以及對(duì)抗體交叉反應(yīng)、特異性和靈敏度的進(jìn)一步檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室還將在以后的工作中不斷完善該檢測(cè)方法。

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