韓美艷 俞冬熠 姜楠 任慧穎

（青島市婦女兒童醫(yī)院遺傳科，山東青島 266034）

影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率因素的分析

韓美艷 俞冬熠 姜楠 任慧穎*

（青島市婦女兒童醫(yī)院遺傳科，山東青島 266034）

目的分析影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素并探索提高成功率的方法。方法以方法改進(jìn)時間為界將羊水細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果分為兩組，對比兩組羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法及培養(yǎng)成功率的差異。結(jié)果改進(jìn)前組的515例羊水病例中失敗32例，失敗率為6.21％。改進(jìn)后組的6736例羊水病例中僅有18例失敗，失敗率為0.27％。結(jié)論及時、正確處理羊水標(biāo)本以及控制影響細(xì)胞培養(yǎng)成功的各個環(huán)節(jié)，可提高羊水細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。

羊水；細(xì)胞培養(yǎng)；產(chǎn)前診斷

通過羊水細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行染色體檢測是產(chǎn)前診斷的重要手段［1-3］，但羊水細(xì)胞培養(yǎng)一直存在著標(biāo)本難以復(fù)得、培養(yǎng)周期長、易污染、分裂象少等問題［4-6］，細(xì)胞培養(yǎng)過程中的每一個環(huán)節(jié)對實驗的成功都具有重要的影響。因此，分析影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素并探索提高成功率的方法，對防止嚴(yán)重的遺傳病具有十分重要的現(xiàn)實意義。近幾年，我們就影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素進(jìn)行了探索，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 2003年1月至2006年12月，符合產(chǎn)前診斷適應(yīng)證如唐氏篩查高風(fēng)險、年齡≥35周歲、不良孕產(chǎn)史及B超合并畸形的孕婦515名進(jìn)行了羊膜腔穿刺，孕周為20～24周，年齡20～50歲。該組為羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法改進(jìn)前組。

1.1.2 2007年1月至2013年12月，上述符合產(chǎn)前診斷適應(yīng)證的孕婦6737人，孕周為19～25周，年齡為20～53歲。該組為羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法改進(jìn)后組。

1.2 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（美國Forma），羊水細(xì)胞培養(yǎng)基（美國GIBCO培養(yǎng)基和張氏培養(yǎng)基）。

1.3 研究方法 通過比較兩組羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法及培養(yǎng)成功率的差異，分析影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素。

1.3.1 改進(jìn)前羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.3.1.1 羊水的抽取與接種 無菌條件下，B超引導(dǎo)定位，抽取羊水30 ml，分別接種于2個培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5.5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。

1.3.1.2 羊水細(xì)胞收獲 棄上清后，將培養(yǎng)瓶中加入37℃預(yù)溫的1％的檸檬酸三鈉低滲液約3 ml，置37℃水浴中低滲30分鐘加入新鮮配置（甲醇∶冰醋酸3∶1）固定液1.5 ml預(yù)固定，靜置5分鐘后用滴管輕輕吹打，移入離心管中，離心，去上清，重復(fù)固定2次。

1.3.1.3 制片、G顯帶及核型分析制片 細(xì)胞沉淀中加入0.5 ml固定液，制成細(xì)胞懸液滴于玻片后，用力吹一口氣，將液面吹開，并快速在酒精燈外焰加熱，固定細(xì)胞。75℃烤箱中烤片2小時后放入37℃恒溫箱存放。

G顯帶用0.025％胰酶消化后，Giemsa染液染色，流水沖洗，空氣自然干燥后.即可在顯微鏡下觀察染色體分裂象。

1.3.2 羊水細(xì)胞培養(yǎng)改進(jìn)措施 自2007年始，我們對羊水細(xì)胞的培養(yǎng)過程進(jìn)行了以下改進(jìn)：①更換注射器，將抽取羊水用的注射器由帶有黑色橡皮塞的普通注射器改為BD公司生產(chǎn)的沒有黑色橡皮塞的注射器。②細(xì)胞培養(yǎng)收獲方式的改進(jìn)，2007年前采用雙線培養(yǎng)單線收獲方式，即將羊水細(xì)胞接種于2個獨(dú)立的培養(yǎng)瓶中，但收獲、制片和核型分析時未能堅持獨(dú)立的雙線。2007年后來我們采用嚴(yán)格雙線培養(yǎng)雙線收獲方式，即每例羊水標(biāo)本分為兩份，分別交由兩位技術(shù)人員，使用不同的培養(yǎng)基，分別置于2個培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，并獨(dú)立完成從細(xì)胞的接種、收獲、制片、分析到出具報告的全過程。③建立量化收獲標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)細(xì)胞生長旺盛，形成中等大小且含有較多圓形細(xì)胞的克隆數(shù)達(dá)到10個或以上時，即可收獲。④制片方式的改進(jìn)：制片時不再用酒精燈外焰加熱，而是將細(xì)胞懸液滴在傾斜的玻片上，放入75℃烤箱，待玻片干燥后取出編號。⑤混血羊水標(biāo)本的處理：當(dāng)羊水標(biāo)本中混有大量血細(xì)胞時，離心后小心吸取沉淀底部血細(xì)胞層上面的羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。同時延長換液時間，約8～9天后換液，用F10溶液沖洗后，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，等克隆數(shù)達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)時進(jìn)行收獲。

核型分析按照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中的《胎兒染色體異常的細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行計數(shù)、分析。計數(shù)時至少計數(shù)在2個以上獨(dú)立培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中平均分布的20個細(xì)胞，記錄染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。分析時至少分析在2以上獨(dú)立培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中的5個細(xì)胞，所分析的細(xì)胞應(yīng)達(dá)到320條帶水平。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN2005）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析診斷。

2 結(jié)果

改進(jìn)前組的515例羊水標(biāo)本中培養(yǎng)失敗32例，失敗率為6.21％。改進(jìn)后組的6736例羊水病例中僅有18例失敗，失敗率為0.27％。兩組的培養(yǎng)結(jié)果對比情況詳見表1。

改進(jìn)前組中，2006年的2批羊水穿刺共22例羊水標(biāo)本中，有20例羊水細(xì)胞未貼壁，培養(yǎng)失敗，經(jīng)查找原因及文獻(xiàn)檢索［2］，發(fā)現(xiàn)是由于注射器的批號改變，可能是黑色膠塞或殘余的有害物對細(xì)胞的毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞不貼壁。另外，4例為技術(shù)人員操作不當(dāng)，引起污染，羊水細(xì)胞培養(yǎng)失?。?例為羊水標(biāo)本嚴(yán)重混血，羊水細(xì)胞貼壁克隆少，收獲后未能獲得足夠的分裂中期細(xì)胞，實驗失敗。

改進(jìn)后組中，18例失敗的病例中，1例是因為羊水細(xì)胞培養(yǎng)后，貼壁細(xì)胞形態(tài)異常，梭長形羊水細(xì)胞量少，兩個培養(yǎng)體系未能收獲到形態(tài)良好的分裂中期細(xì)胞，實驗失??；8例為技術(shù)人員操作不當(dāng)引起污染，羊水細(xì)胞培養(yǎng)失??；6例為存在陳舊性出血的羊水標(biāo)本，羊水呈現(xiàn)黃綠色或深棕褐色，混有大量小塊兒狀沉淀，培養(yǎng)后羊水細(xì)胞貼壁克隆量少，未能收獲到染色體核型；3例為嚴(yán)重混血的羊水標(biāo)本，且在羊水標(biāo)本離心前已發(fā)生凝集反應(yīng)，大量的羊水細(xì)胞被凝集在凝塊中，導(dǎo)致貼壁細(xì)胞減少，培養(yǎng)失敗。

3 討論

通過羊水細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷是目前廣泛應(yīng)用的技術(shù)，但是要獲得羊水需進(jìn)行羊膜腔穿刺，這項技術(shù)對孕婦及胎兒仍存在一定的風(fēng)險，可造成孕婦和胎兒的損傷、感染，流產(chǎn)發(fā)生率為0.2％［7，8］。羊水細(xì)胞主要來源于胎兒皮膚、消化、呼吸道等脫落細(xì)胞，細(xì)胞大部分是衰老和固縮的，脫落細(xì)胞中活性細(xì)胞數(shù)量較少，體外培養(yǎng)相對困難［7］。羊水產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵技術(shù)是細(xì)胞的培養(yǎng)和染色體的制備，影響羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素很多［9］，但主要是培養(yǎng)基的質(zhì)量和羊水中存活細(xì)胞的數(shù)目以及制片技術(shù)影響獲得染色體核型的質(zhì)量和數(shù)量，因此，提高羊水細(xì)胞染色體產(chǎn)前診斷的成功率和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵在于增加存活羊水細(xì)胞的數(shù)量和提高制片技術(shù)［8］。為確保羊水培養(yǎng)成功，避免導(dǎo)致孕婦行第2次穿刺，我們通過不斷探索和改良，根據(jù)本實驗室現(xiàn)有條件逐漸摸索出了一套較為成熟的羊水培養(yǎng)方法，并在實踐中得到驗證。

表1 羊水細(xì)胞培養(yǎng)情況統(tǒng)計表（例）

3.1 器械和耗材 采集抽取羊水標(biāo)本所用的容器必須保證無細(xì)胞毒性，以免降低細(xì)胞活性，影響羊水細(xì)胞的貼壁生長。BD公司的注射器不帶有黑色膠塞，所以沒有細(xì)胞毒性，而且包裝的一側(cè)為紙質(zhì)，有利于消毒劑環(huán)氧乙烷的揮發(fā)，和普通的20 ml注射器相比，大大減少了對細(xì)胞活性的影響。更換為BD公司的注射器后，6737例羊水培養(yǎng)實驗中，未出現(xiàn)因容器對羊水細(xì)胞的毒性作用導(dǎo)致的實驗失敗。

3.2 構(gòu)建兩個獨(dú)立、平行的培養(yǎng)收獲體系 每例羊水標(biāo)本分為兩份，分別交由兩位技術(shù)人員，使用不同的培養(yǎng)基，分別置于2個培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并獨(dú)立完成從細(xì)胞的接種、收獲、制片、分析到出具報告的全過程。這樣可以避免因單人操作不當(dāng)而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的發(fā)生，提高實驗的成功率。同時兩個獨(dú)立、平行的培養(yǎng)收獲體系相當(dāng)于雙盲對照，有助于及時發(fā)現(xiàn)差錯，提高診斷的準(zhǔn)確性。而且，只有構(gòu)建兩個獨(dú)立、平行的培養(yǎng)收獲體系才能對羊水細(xì)胞核型的真假嵌合進(jìn)行合理有效的判定。

3.3 制片 滴片后猛吹一口氣會導(dǎo)致染色體核型的大量丟失；再在酒精燈外焰加熱，個體操作難以標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)而導(dǎo)致G顯帶中胰酶處理時間的差異較大，增加實驗失敗的風(fēng)險。將細(xì)胞懸液滴于傾斜的玻片上，液體下滑的同時，染色體可以分散、延伸，從而能得到分散較好的染色體核型，且染色體核型丟失較少。置于75℃烤箱干燥過程易于標(biāo)準(zhǔn)化，G顯帶中胰酶處理時間的差異不大，有利于提高實驗的成功率。

3.4 血性羊水標(biāo)本的處理 混血的羊水標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)時，大量的血細(xì)胞沉淀于瓶底，會影響羊水細(xì)胞的貼壁［10-15］，離心后棄去沉淀底部的紅細(xì)胞，吸取沉淀上層的羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以減少培養(yǎng)體系中的血細(xì)胞，同時延長換液時間，約8～9天后換液，用F10溶液沖洗，更換新鮮的培養(yǎng)基，可以進(jìn)一步去除殘余血細(xì)胞，有利于羊水細(xì)胞的貼壁生長。

3.5 量化收獲標(biāo)準(zhǔn) 要收獲較多的分裂象應(yīng)該選擇適當(dāng)?shù)氖斋@時機(jī)。10倍目鏡和10倍物鏡下觀察：以梭長形羊水細(xì)胞（AF細(xì)胞）為主要類型的生長細(xì)胞，形成的細(xì)胞克隆覆蓋1個或1個以上的完整視野，定義為一個中型克隆，當(dāng)一個培養(yǎng)瓶中有10個以上中型克隆，細(xì)胞克隆中央的細(xì)胞開始老化，克隆周邊細(xì)胞生長旺盛，且每個細(xì)胞克隆中存在20個以上的圓形、雙圓形或葡萄狀透亮細(xì)胞時，可進(jìn)行收獲，可以獲得較多的染色體分裂中期細(xì)胞。

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編輯：鄒剛

ObjectiveTo Analysis the factors affecting the success rate of amniotic fluid cell culture and to investigate the methods to improve the success rate.MethodBy the time of improving the method，amniotic fluid cell culture results were divided into two groups.We compared the differences of the two groups of amniotic fluid cells culture method and the success rate.ResultsIn the first group of 515 cases of amniotic fluid，32 cases of amniotic fluid cell culture failed，the failure rate is 6.21％.In the improved group of 6736 cases of the amniotic fluid，only 18 cases failed，the failure rate is 0.27％.ConclusionsTimely and correctly handle the amniotic fluid specimens and control each link effect the success of the cell culture，can improve the success rate of amniotic fluid cell culture.

amniotic fluid；cell culture；prenatal diagnosis

R394.2

A

10.13470/j.cnki.cjpd.2014.03.011

2014-07-18）

*通訊作者：任慧穎，E-mail：renhuiying7812＠126.com