錢欣 王建莉

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江杭州 310006）

遺傳性疾病產(chǎn)前診斷方法及其進展

錢欣 王建莉*

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江杭州 310006）

遺傳性疾?。ê喎Q遺傳病）是指以遺傳因素作為惟一或主要致病因素的一大類疾病，遺傳因素以細胞水平的染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)畸變和分子水平的基因改變?yōu)橹?。?jù)統(tǒng)計，活產(chǎn)新生兒中患不同種類遺傳病者占4％～5％，其中單基因病占1％，多基因病占2％～3％，染色體病占0.5％。約1％新生兒患嚴重畸形，0.5％有代謝異常［1］。隨著臨床遺傳學(xué)的發(fā)展，分子遺傳學(xué)等新技術(shù)的應(yīng)用，使很多并不常見的遺傳病得以診斷、治療、預(yù)防并進行有效的產(chǎn)前診斷。

遺傳病通常分為3種類型：①染色體?。╟hromosomal disorder），指由染色體數(shù)目異常或結(jié)構(gòu)畸變所引起的一類疾病。分為常染色體病與性染色體病。染色體數(shù)目異常多數(shù)由于同源染色體或姐妹染色體不分離所致，臨床上常見整倍體畸變、非整倍體畸變（單體綜合征、三體綜合征等）和嵌合體等表現(xiàn)形式。結(jié)構(gòu)畸變則由染色體斷裂丟失或錯誤重接所致，如缺失、倒位、重復(fù)、易位等結(jié)構(gòu)異常。目前已報道的染色體病超過300種，分布在22條常染色體和2條性染色體上。染色體病患者智力顯著低下，缺乏勞動和生活自理能力，會給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)。所以深入研究其發(fā)生的原因和采取預(yù)防措施是亟待解決的課題。②單基因遺傳?。╯ingle gene disorder；monogenic disease；monogenic disorder），指單個基因突變所引起的一類疾病。致病基因存在于核基因中，亦存在于線粒體基因中；前者發(fā)病方式遵循孟德爾遺傳規(guī)律，而后者不符合孟德爾遺傳規(guī)律，屬于母系遺傳或細胞質(zhì)遺傳范疇。該類疾病的群體患病率約為1/10000，病種約有6000多種。③多基因遺傳病（polygenic disorder；multifactorial disease），指由多個易感基因突變在環(huán)境因素（如物理、化學(xué)或生物因素）影響下所導(dǎo)致的疾病。常見的多基因病有糖尿病、高血壓和唇腭裂等，群體患病率在0.1％～1.0％之間。

遺傳病的產(chǎn)前診斷主要通過獲取胎兒細胞進行出生前的遺傳病診斷。目前臨床上用于胎兒細胞采集的方法有羊膜腔穿刺術(shù)（amniocentesis），絨毛活檢術(shù)（chorionic villi sampling，CVS），經(jīng)皮臍血穿刺術(shù)（cordocentesis）等。

1 產(chǎn)前診斷標本獲取

1.1 羊膜腔穿刺術(shù)獲取胎兒樣本 羊水細胞是產(chǎn)前診斷中最常用的標本之一，其主要來源于胎兒皮膚、消化道、呼吸道等脫落上皮細胞。根據(jù)其形態(tài)學(xué)和生物學(xué)生長特性，可分為羊水特異性細胞、上皮樣細胞和成纖維細胞［2］。羊水標本取材風(fēng)險相對較小，多大型多中心研究已經(jīng)證實了羊水穿刺的安全性及其細胞遺傳學(xué)診斷的準確性（超過99％）［3］。一般在妊娠18～23周時，于B超引導(dǎo)下經(jīng)腹部行羊膜腔穿刺，取20～25 ml羊水，培養(yǎng)成功率較高。文獻報道羊膜腔穿刺術(shù)自發(fā)流產(chǎn)率為1.4％～3.5％［3］，與醫(yī)生經(jīng)驗有密切關(guān)系，在本院約為0.1％。

1.2 絨毛膜穿刺術(shù)獲取胎兒樣本 絨毛組織從受精卵發(fā)育而成的，位于胚囊之外且又具有和胚胎同樣的遺傳性，利用絨毛進行產(chǎn)前診斷，多于妊娠9～11周進行，早孕期絨毛活檢被認為是產(chǎn)前診斷的一個突破，通過提取出絨毛組織可以對胎兒行基因與酶學(xué)診斷，最大限度降低遺傳性疾病患兒的出生。取絨毛要求較高的技術(shù)，醫(yī)生的經(jīng)驗是至關(guān)重要的。目前獲取絨毛標本最常用的方法是經(jīng)宮頸絨毛活檢，成功率高到98.2％，胎兒丟失率為3.5％，自發(fā)流產(chǎn)率為2.6％～4.5％，缺點是絨毛膜樣本容易存在母血污染［4］，有報道稱早期絨毛活檢相關(guān)流產(chǎn)率與中期羊水穿刺相似［3］。行絨毛活檢時若胎盤厚度不足應(yīng)延期手術(shù)，穿刺中應(yīng)避免穿刺針過于靠近母體面以免母體組織污染。早期絨毛膜活檢的臨床診斷率明顯高于孕中期［3］，超聲篩查的介入對于早期診斷胎兒染色體異常具有關(guān)鍵作用，所以在臨床開展早期篩查與早孕期診斷具有十分重要的意義。

1.3 經(jīng)皮臍血穿刺術(shù)獲取胎兒樣本 經(jīng)皮臍血穿刺一般在妊娠23周后進行。當羊水細胞培養(yǎng)失敗或是錯過最佳羊水穿刺者可選擇行經(jīng)皮臍血穿刺術(shù)進行產(chǎn)前診斷。臍靜脈穿刺較臍動脈穿刺更為簡單、安全，后者會增加心動過緩或穿刺后出血時間延長的發(fā)生率?？梢愿鶕?jù)臍動靜脈相對大小的不同與Doppler彩色血流圖中血流的方向來區(qū)分動靜脈。有文獻報道臍帶穿刺術(shù)失敗率為9％［5］，故本取材方法比上述兩種取材術(shù)的相關(guān)并發(fā)癥和流產(chǎn)率均增高，推薦本取材法僅適用于作為產(chǎn)前診斷的補救措施或某些特殊疾病的診斷手段，不應(yīng)該成為產(chǎn)前診斷的常規(guī)手段。

1.4 母體外周血中胎兒游離DNA的獲取 1997年Lo等［6］利用傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)PCR首次發(fā)現(xiàn)在孕婦血漿中存在游離的胎兒DNA，不久后其他學(xué)者也證實了循環(huán)胎兒DNA的存在并已顯示出其潛在的臨床應(yīng)用價值。母血胎兒游離DNA主要來源于孕婦凋亡的胎盤滋養(yǎng)層細胞，其特點是：①均以小片段的形式存在，80％的胎兒游離DNA片段小于193 bp；②半衰期短，僅16分鐘左右，其數(shù)量因此總保持在較低的水平，約占整個血漿總DNA含量的3％～6％［7］。Lo等［8］通過對妊娠期產(chǎn)后婦女血漿中胎兒細胞內(nèi)DNA和胎兒游離DNA的比較發(fā)現(xiàn)，59％的孕婦在孕5～8周時血漿中即能檢測到胎兒游離DNA，在孕7～16周時明顯升高，并隨孕周增加而升高，于分娩時達到高峰。因此可以通過采集母體外周血，從而獲取胎兒的游離DNA。

2 遺傳病產(chǎn)前診斷技術(shù)

2.1 染色體核型分析 根據(jù)染色體的長度、著絲點位置、臂比以及隨體的有無等特征，并借助染色體顯帶技術(shù)對染色體進行分析、比較、排序和編號。

染色體核型分析是遺傳性疾病產(chǎn)前診斷的主要方法。常用的染色體核型分析技術(shù)有：①非顯帶染色體核型分析：通常采用Giemsa染液對染色體標本進行染色處理，結(jié)果整條染色體顯示紫紅色。非顯帶染色體標本上雖然可以根據(jù)染色體的形態(tài)識別1、2、3、16、17和18號，有時還可以識別Y染色體，但卻不能有把握地鑒別其他大多數(shù)染色體。②顯帶染色體核型分析：用各種不同的方法與不同的染料處理染色體標本，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間、深淺不同的帶紋的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)。自20世紀70年代以來，顯帶技術(shù)得到了很大發(fā)展，其中G顯帶是應(yīng)用最廣泛的一種顯帶技術(shù)。人類染色體標本經(jīng)胰蛋白酶、NaOH與緩沖液等試劑處理后再用Giemsa染色，可使每條染色體上呈現(xiàn)出深淺交替的橫紋，這就是G顯帶技術(shù)。因每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，可以較為準確的識別及診斷經(jīng)G顯帶處理的染色體標本。

關(guān)于G顯帶的機理目前有多種說法，Lee等認為染色體上與DNA結(jié)合較為疏松的組蛋白易被胰蛋白酶分解，經(jīng)染色后這些區(qū)段成為淺帶，而組蛋白和DNA結(jié)合牢固的區(qū)段則被染成深帶。也有人認為，易著色的陽性帶為含有較多AT的染色體節(jié)段，而含GC多的染色體段則不易著色?？偟膩碚f，G顯帶的機理尚未得到定論。

自1970年Caspersson等首次報道用喹吖因?qū)θ梭w染色體進行染色可在各號染色體上顯現(xiàn)出寬窄不一帶紋以來，細胞遺傳學(xué)者以不同的染色方法為基礎(chǔ)，提出各種顯帶方法的名稱。

如用Q顯帶法以芥子喹吖因作為染料，染出的熒光帶稱為Q帶；G顯帶法用Giemsa作為染料，染出的帶稱為G帶；R顯帶法同樣用Giemsa作為染料，因預(yù)處理不同獲得與G帶著色強度正好相反，染出的帶稱為R帶；C顯帶法專一的顯示“結(jié)構(gòu)性異染色質(zhì)”，稱為C帶；T顯帶用于鑒別染色體的端粒；N顯帶則在核仁組織區(qū)濃染。

2.2 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù) 用帶熒光標記的物質(zhì)將目的DNA片段標記，然后將其雜交到中期染色體或間期染色質(zhì)纖維上，在熒光顯微鏡下觀察，判斷目的DNA在染色體上的位置或在間期核中的數(shù)目，主要用于檢測染色體微小片段的改變或直接檢測間期細胞核中染色質(zhì)的變化。用于FISH檢測的探針分為直接標記探針與間接標記探針兩種，前者應(yīng)用藕聯(lián)熒光分子的d NTP標記探針，雜交洗滌后可直接在熒光顯微鏡下檢測；后者則采用生物素或地高辛等分子的d NTP標記探針，雜交洗滌后用偶聯(lián)有熒光分子的具有高度特異性與親和力的抗生物素或抗地高辛抗體進行免疫熒光擴增，最后在熒光顯微鏡下觀察分析。兩種方法的比較：①直接標記的探針雜交后經(jīng)簡單洗滌即可顯示雜交信號，簡單方便，而間接標記的探針雜交后需通過一系列檢測步驟，容易引起較高的背景；②間接標記的探針可進行多步驟信號放大，直接標記的探針熒光信號不能放大；③多色FISH選擇直接標記探針較多。

2.3 微陣列比較基因組雜交技術(shù)（Array CGH）需提取樣本中的基因組DNA，并與基因芯片雜交，雜交結(jié)果通過生物信息學(xué)的方法，分析樣本染色體可能存在的微缺失、微重復(fù)。該技術(shù)是FISH技術(shù)的延伸，其基本原理是用不同的熒光染料分別標記待測DNA樣本與參考DNA樣本，等量混合后與微陣列玻片上的oligonucleotide探針進行競爭性雜交。Array CGH技術(shù)可在一張芯片上實現(xiàn)全基因組檢測和基因組異常的解析，在染色體微結(jié)構(gòu)畸變、追溯標記染色體來源等方面具有明顯的優(yōu)勢，幾乎可以檢測出除基因突變或染色體平衡易位以外的基因組失衡。研究顯示，有智力障礙、畸形、發(fā)育障礙等提示染色體病的癥狀，但核型分析為正?；蚱胶庖孜坏幕颊?，應(yīng)用Array CGH后其異常檢出率約為10％～50％［9］。主要優(yōu)勢體現(xiàn)在：無需細胞培養(yǎng)；全基因組覆蓋檢測；分辨率高于核型分析；準確檢測全部染色體非整倍體疾病，以及染色體微缺失、微重復(fù)疾病。

2.4 多重酶聯(lián)依賴探針擴增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）由Schouten等于2002年首先報道，是一種針對被測DNA序列進行定性與半定量分析的新技術(shù)。具有高效性、特異性，并在一次反應(yīng)中可以檢測多達45個核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，目前已經(jīng)應(yīng)用于多個臨床領(lǐng)域、多種疾病的研究?；驹頌榘行蛄蠨NA和探針雜交后通過連接、PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳分離，分析軟件對收集到的數(shù)據(jù)進行分析，最后得出結(jié)論。每一個MLPA探針都包含一對熒光標記的寡核苷酸片段，其中一個由化學(xué)合成，而另一個則由M13噬菌體衍生法制備。每個探針都有一段引物序列與一段特異性序列。MLPA反應(yīng)時，寡核苷酸片段與靶序列雜交后通過連接酶連接兩部分探針。因連接反應(yīng)特異性高，只有當靶序列與探針特異性序列完全互補，連接酶才能將兩段探針連成一條完整的核酸單鏈；若靶序列與探針序列不能完全互補，即使它們之間只相差一個堿基，也會導(dǎo)致雜交不完全，使連接反應(yīng)無法進行。當連接反應(yīng)完成后，用一對通用引物擴增連接好的探針，其擴增產(chǎn)物的長度惟一且穩(wěn)定，范圍在130～480bp。最后，經(jīng)毛細管電泳分離擴增產(chǎn)物，再通過軟件分析，得出結(jié)論。只有當連接反應(yīng)順利完成，才能進行PCR擴增并收集相應(yīng)的探針的擴增峰，當檢測的靶序列發(fā)生點突變、缺失或重復(fù)時，相應(yīng)探針的擴增峰便會隨之缺失、降低或增加，因此可以根據(jù)擴增峰的改變判斷靶序列是否有拷貝數(shù)異?；螯c突變存在。

MLPA目前多用于檢測染色體的非整倍體改變與SNP多態(tài)性或點突變，在一些可以明確診斷的單基因病中也有較多的應(yīng)用。MLPA結(jié)合了PCR擴增與DNA探針雜交技術(shù)，具有較多的優(yōu)點，主要體現(xiàn)在①特異性，可以針對單一位點進行點突變檢測；②高效性，一次反應(yīng)可以檢測45個靶序列的拷貝數(shù)改變；③快速性，一次檢測可以在24小時內(nèi)完成；④簡便性，多采用試劑盒進行相關(guān)檢測，操作簡單且容易掌握。MLPA也存在一定的局限性，如檢測需要精確的DNA濃度，不能用于單個細胞檢測，只適用于檢測已知的基因缺失或重復(fù)，不能檢測未知的畸變，亦不能檢測染色體平衡易位等。但MLPA作為一種新興的分子遺傳學(xué)技術(shù)，其發(fā)展空間大，應(yīng)用領(lǐng)域也會日益廣泛。

2.5 定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative-fluorescent multiplex polymersa chain reaction，QF-PCR）

是一種利用熒光引物對染色體也行的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）位點進行擴增，經(jīng)熒光檢測對染色體數(shù)目異常做出快速診斷的方法。其優(yōu)點主要表現(xiàn)在高效性、高特異性與快速性等方面。STR遺傳多態(tài)性主要通過雜合度與多態(tài)信息量等指標來衡量。當多態(tài)信息量＞0.5時，表明遺傳標記可提供高度的遺傳信息［10］。STR位點的基因頻率、雜合度等因樣本來源、種族差異等不同而有所差異。故使用STR位點做快速產(chǎn)前診斷時，應(yīng)對選取的的位點進行統(tǒng)計學(xué)分析，選取可提供高度遺傳信息、高雜合度的位點進行檢測。未在QF-PCR非整倍體診斷中使用過的新STR位點應(yīng)進行大樣本（＞100）驗證后使用，包括在非整倍體樣本中確認標記序列的位置，并排除常見的多態(tài)性。正常的二倍體細胞的2個等位基因在QF-PCR檢測過程中會優(yōu)先擴增其中的一個，其產(chǎn)物會被作為模板過度表達［11］，所以在實驗結(jié)果中等位基因峰面積比值并不是理論上的1∶1，文獻報道正常雜合二倍體的峰面積比一般在0.8～1.4之間［12］；三體綜合征患者的峰面積比理論值為1∶1∶1或1∶2/2∶1，實際檢測中當3個等位基因中有兩個等位基因比值在0.45～0.65或1.8～2.4，即可定義三體。因QF-PCR檢測結(jié)果受到位點選擇、STR雜合度等因素的影響，故在臨床項目開展中應(yīng)充分考慮其局限性。

2.6 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測 通過采集孕婦5ml外周血，提取胎兒游離DNA，通過新一代高通量測序技術(shù)，并結(jié)合生物信息分析，得出胎兒患染色體非整倍性疾?。?1三體，18三體，13三體）的風(fēng)險率。該方法最佳檢測時間為孕早、中期，具有無創(chuàng)取樣、無流產(chǎn)風(fēng)險、高靈敏度，高準確性的特點。

在對胎兒游離DNA清除率的研究中發(fā)現(xiàn)，因血漿中胎兒游離DNA半衰期短，其水平能實時地反映胎兒DNA的生成和清除。因此孕婦外周血中胎兒游離DNA具有濃度高、清除快、高敏感性且易于分析的特征，這種循環(huán)胎兒游離DNA的存在使無創(chuàng)傷產(chǎn)基因檢測技術(shù)應(yīng)運而生。目前為止國內(nèi)已完成數(shù)萬樣本量的檢測，檢出率達99.9％，準確率達99.7％。

綜上所述，表1列出各種產(chǎn)前診斷技術(shù)的優(yōu)勢之處與各自的局限性。隨著細胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，產(chǎn)前診斷的新技術(shù)理論知識的不斷完善，未來會有更多的檢測技術(shù)朝著高特異性、高檢出率、高分辨率、高覆蓋率及低成本、低耗時、低誤差、低并發(fā)癥等方向發(fā)展，相信在不久的將來，各種產(chǎn)前診斷技術(shù)將更好的服務(wù)于社會，并為優(yōu)生優(yōu)育做出巨大貢獻。

表1 各種遺傳病檢測技術(shù)的比較

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編輯：宋文穎

R714.55

A

10.13470/j.cnki.cjpd.2014.03.013

2014-04-02）

*通訊作者：王建莉，Email-jlwang＠zju.edu.cn