曲孟，李秀辰，白曉磊，楊福利，孫彩玲

(大連海洋大學 遼寧省漁業(yè)裝備工程技術研究中心，遼寧大連116023)

近年來，微藻作為一種重要的食品、化工和可再生能源的原料，備受人們關注［1-4］。但迄今為止，微藻的濃縮采收一直未能實現(xiàn)規(guī)模化生產，其原因是微藻細胞小、濃度低，采收成本過高［5-6］。目前，生產過程中常用的采收方法有離心分離法、過濾法、泡載分離法、絮凝沉淀法和氣浮分離法等［7-8］，其中絮凝沉淀法具有操作簡單、設備投資少等優(yōu)點，常與其他方法一起配合使用［9-10］，但絮凝劑的選擇很關鍵。張亞杰等［11］開展了聚合氯化鋁(PAC)、聚合硅酸硫酸鋁(PASS)和聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDADMA)絮凝小球藻的研究，并對其實際應用的經濟性進行了評價，得出最低濃縮成本約為589 元/t;Divakaran等［12］研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對于小球藻具有較好的絮凝效果;張國權等［13］利用殼聚糖絮凝小球藻，降低了現(xiàn)行的采收成本，為生產食用級的微藻產品提供了依據(jù);岳偉萍等［14］利用氫氧化鈉對海鏈藻Thalassiosira nordenskioldi 進行絮凝試驗發(fā)現(xiàn)，當氫氧化鈉的質量濃度為0.05 g/L 時，細胞的采收率可達85%;呂樂等［15］發(fā)現(xiàn)，納米鐵具有高效沉降藍藻的效果，當pH 為5 時，10 min 內可以絮凝沉降89.6%以上的水華藍藻Cyan bacteria 細胞。

氫氧化鈣是一種廉價易得的絮凝劑，電離產生游離Ca2+及各種帶正電荷的水解產物，小球藻表面的多羥基有機酸或糖類發(fā)生離解，從而使藻細胞表面帶有一定量的負電荷，兩者通過吸附或者電中和聚團沉降［16-18］，而加入的氫氧化鈣可以在培養(yǎng)微藻過程中用CO2去除，因此，氫氧化鈣絮凝微藻具有一定的優(yōu)勢。但由于氫氧化鈣的水溶性較低，且容易受藻液體系的pH、鹽度等因素的影響，過多的添加量不僅達不到微藻采收的要求，且容易造成水體污染和成本浪費。薛蓉等［19］對比了硫酸鐵、硫酸鋁、三氯化鐵和氫氧化鈣對小球藻的絮凝效果，發(fā)現(xiàn)用氫氧化鈣作為絮凝劑，成本最低，且上層清液可以繼續(xù)用于培養(yǎng)小球藻，但是并未對絮凝條件進行優(yōu)化。本研究中，選用氫氧化鈣作為絮凝劑，在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法［20］對小球藻的絮凝條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

小球藻Chlorella vulgaris 購自大連匯新鈦設備開發(fā)有限公司，氫氧化鈣(分析純)購自天津博迪化工股份有限公司。

試驗用儀器主要有 BSA124S 型電子天平、UV-7504 紫外可見分光光度計、雷磁pH-2F型pH 計、CX41 型生物顯微鏡。

1.2 方法

試驗用小球藻原藻液的pH 為8.24，細胞密度為8.03×107個/mL，在680 nm 波長下的吸光度值(OD680nm)為0.921。

1.2.1 測定方法

(1)小球藻的細胞濃度。測定藻液在680 nm波長下吸光度值，用以間接表示小球藻生物量的變化，記為OD680nm［21］。

(2)小球藻的采收率。取100 mL 藻液，加入不同量的氫氧化鈣，利用磁力攪拌器攪拌3 min，待均勻后靜置，用注射器緩慢抽取液面下4 cm 處的藻液，測定OD680nm，根據(jù)下式計算微藻的采收率:

其中:OD0為初始時刻藻液的OD680nm;ODt為絮凝時間t 時藻液的OD680nm。

1.2.2 單因素試驗設計

(1)絮凝時間對采收率的影響試驗。取100 mL 藻液，按0.1、0.3、0.8、1.6 g/L 加入氫氧化鈣，利用HJ-3 型恒溫磁力攪拌器攪拌3 min 后絮凝，每隔20 min 用注射器分別緩慢抽取各組液面下4 cm 處的藻液，測定OD680nm，每次取3 個平行樣求平均值，并計算采收率。

(2)絮凝劑添加量對采收率的影響試驗。取100 mL 藻液，按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、1.8、2.0 g/L 加入氫氧化鈣，固定絮凝時間，測定OD680nm，每次取3 個平行樣求平均值，并計算采收率。

(3)藻液濃度對采收率的影響試驗。取100 mL 原藻液，用蒸餾水分別稀釋為原來的2、4、6、8、10 倍，固定絮凝時間和氫氧化鈣添加量，測定OD680nm，每次取3 個平行樣求平均值，并計算采收率。

(4)藻液pH 對采收率的影響試驗。利用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L NaOH 調節(jié)藻液pH 為8 ～12，加入固定量的氫氧化鈣，絮凝一定時間，觀察不同藻液pH 對絮凝效果的影響。

1.2.3 響應面法優(yōu)化試驗設計 以單因素試驗為基礎，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理，選取對小球藻采收率影響顯著的因素，以3次平行試驗所得的小球藻采收率的平均值作為響應值(Y)，通過Design Expert 8.0.5 軟件進行響應面分析，在此基礎上得出各因素之間的最佳組合。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 絮凝時間對絮凝效果的影響 從圖1可見:絮凝劑添加量為0.3、0.8、1.6 g/L 時，小球藻的采收率隨絮凝時間的增加而增大，前60 min 增加趨勢明顯，60 min 時采收率分別達到29.8%、80.5%和85.3%，之后，絮凝趨于穩(wěn)定;當絮凝劑添加量為0.1 g/L 時，絮凝效果不明顯，采收率小于3.5%。絮凝時間相同時，采收率隨著絮凝劑添加量的增加而增大，絮凝時間為80 min 時，4 個絮凝劑添加量下小球藻的采收率分別為3.2%、30.3%、84.3%、89.4%。一般來說，絮凝時間越長，絮凝劑與藻細胞之間、藻細胞相互之間接觸越充分，結團沉降就越完全，采收率也越高。薛蓉等［19］研究發(fā)現(xiàn)，利用氫氧化鈣絮凝小球藻90 min時，采收率在90%左右，但是如果絮凝時間過長，生產周期延長，細胞的活性也可能會發(fā)生改變。因此，考慮生產周期成本以及藻體的質量，在本試驗條件下，絮凝時間為60 ～80 min 時，絮凝效果較好。

2.1.2 絮凝劑添加量對絮凝效果的影響 從圖1可見:隨著絮凝劑添加量的增加，小球藻采收率隨之增高;當絮凝劑添加量為0.6 g/L 時，小球藻絮凝效果驟增，采收率達到80.7%;絮凝劑添加量再增加時，采收率增加緩慢，當絮凝劑添加量從0.6 g/L 增加到1.4 g/L，采收率僅從80.7%增加到92.2%。這是由于絮凝劑添加量增加，藻體與絮凝劑之間的碰撞幾率增大，絮凝效果顯著，特別是當絮凝劑添加量增加到使藻液體系正負電荷中和的時候，絮凝效果最好，可獲得較高的采收率。繼續(xù)增加絮凝劑添加量，其對絮凝效果的影響減弱。因此，考慮到成本問題及后續(xù)生產的要求，在本試驗條件下，絮凝劑添加量為0.6 ～0.8 g/L 時，絮凝效果較好。

2.1.3 小球藻濃度對采收率的影響 從圖1可見:隨著藻液濃度的降低，采收率隨之降低;當稀釋倍數(shù)為8 倍時，采收率達84.5%，但當稀釋倍數(shù)從8倍增加到10 倍時，采收率從84.5% 急劇降到58.9%。可見，對于低濃度藻液，絮凝劑與藻細胞、藻細胞之間碰撞結團的幾率相對減少，采收率隨之降低。繼續(xù)稀釋時，體系中藻細胞數(shù)量較少，所帶的負電荷不足以中和絮凝劑電離產生的陽離子所帶的正電荷，從而產生一定的排斥作用，致使采收率下降較明顯。因此，在本試驗條件下，稀釋倍數(shù)為2 ～8 倍時，絮凝效果較好。

圖1 絮凝時間、絮凝劑添加量、小球藻濃度對采收率的影響Fig.1 Effects of flocculation time，flocculant dosage，and Chlorella vulgaris concentration on recovery ratio

2.1.4 藻液pH 對絮凝效果的影響 從表1可見:隨著藻液pH 的增加，小球藻采收率下降，當藻液pH 由8 升至10 時，采收率由95.7%降至85.3%。這是由于隨著pH 的增加，氫氧化鈣的溶解性降低，電離產生的陽離子數(shù)量減少的緣故。倘若降低藻液pH，雖然有利于小球藻的采收，但對于其細胞的正常生長可能會產生影響，既不利于小球藻的循環(huán)培養(yǎng)，又會造成水體污染，從而增加了處理成本。當藻液pH 為11 ～12 時，產生的絮凝物過于分散，達不到采收要求，且沉淀的小球藻顏色部分發(fā)白，這可能是由于過高的堿性使得藻細胞大量失水而失去活性。因此，在本試驗條件下，小球藻藻液的pH 為8 ～10 時，絮凝效果較好。

2.2 響應面法優(yōu)化絮凝條件

絮凝時間、絮凝劑添加量和藻液pH 試驗3 個因素的水平見表2，試驗設計及試驗結果見表3。

表2 響應面試驗因素水平表Tab.2 Factors and levels in a response surface analysis(RSA)test

表3 響應面試驗設計及試驗結果Tab.3 Design and results of RSA test

運用Design Expert 8.0.5 軟件對采收率試驗結果進行回歸分析，得到二次回歸模型為

對模型(2)中各因素進行方差分析。從表4可見:絮凝時間、絮凝劑添加量和藻液pH 對采收率均有極顯著性影響(P＜0.01)，其中絮凝劑添加量的影響最顯著，其次是絮凝時間和藻液pH;絮凝時間與藻液pH 的交互作用以及絮凝劑添加量與藻液pH 的交互作用對采收率均有極顯著性影響(P＜0.01)，且前者要大于后者，而絮凝時間與絮凝劑添加量的交互作用對采收率的影響不顯著(P＞0.05);回歸方程也具有極顯著性(P＜0.01)，即絮凝時間、絮凝劑添加量和藻液pH 對采收率影響均極顯著。

表4 采收率回歸方程的方差分析Tab.4 ANOVA analysis of recovery ratio regression

響應曲面和等高線如圖2 ～圖4所示。從圖2可見，曲面中的最高點在絮凝時間和絮凝劑添加量均達到最大時得到，和單因素試驗結果一致，說明絮凝時間和絮凝劑添加量的交互作用對采收率的影響較低。從圖2 ～圖4可見:絮凝時間與藻液pH的交互作用對采收率的影響最顯著;絮凝劑添加量對采收率的顯著性影響要高于絮凝時間，絮凝時間和絮凝劑添加量對采收率的顯著性影響均高于藻液pH，3 個因素對采收率的顯著性影響依次為絮凝劑添加量＞絮凝時間＞藻液pH。響應面法分析結果與方差分析結果一致。

圖2 Y=f(A，B)的響應面Fig.2 Responsive surface plot Y=f(A，B)

圖3 Y=f(A，C)的響應面Fig.3 Responsive surface plot Y=f(A，C)

圖4 Y=f(B，C)的響應面Fig.4 Responsive surface plot Y=f(B，C)

綜上所述，利用氫氧化鈣絮凝采收小球藻時，3 個因素中絮凝劑添加量對小球藻采收率的影響最顯著，因此，首先要控制絮凝劑的添加量;同時，考慮到3 個交互作用中絮凝時間與藻液pH 的交互作用對采收率的影響最顯著，合理控制絮凝時間與藻液pH 的交互作用，均可提高小球藻的采收率。

3 結論

(1)單因素試驗結果表明，當絮凝時間為60 ～80 min、氫氧化鈣添加量為0.6 ～0.8 g/L和藻液的pH 為8 ～10 時，最有利于小球藻的采收。

(2)三因素三水平的響應面試驗結果表明，各因素對小球藻采收率均有極顯著性影響，依次為絮凝劑添加量＞絮凝時間＞藻液pH，絮凝時間與藻液pH 以及絮凝劑添加量與藻液pH 的交互作用對小球藻采收率均有極顯著性影響。絮凝時間、絮凝劑添加量和藻液pH 對小球藻采收率的影響可用二次回歸模型來描述。通過響應面法優(yōu)化得出，當絮凝時間為77 min、絮凝劑添加量為0.7 g/L和藻液pH 為9.3 時，小球藻采收效果最好，采收率為93.9%。

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