謝海軍 傅光華※ 陳紅梅 萬(wàn)春和

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所福州350013；2.江西省贛州市章貢區(qū)農(nóng)業(yè)和糧食局能源辦贛州341000；3.江西省贛州市章貢區(qū)農(nóng)業(yè)和糧食局動(dòng)物防疫檢疫站贛州341000）

一例櫻桃谷種鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染的診斷

劉偉1林貴富2謝海軍2蔡小敏3傅光華※1陳紅梅1萬(wàn)春和1

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所福州350013；2.江西省贛州市章貢區(qū)農(nóng)業(yè)和糧食局能源辦贛州341000；3.江西省贛州市章貢區(qū)農(nóng)業(yè)和糧食局動(dòng)物防疫檢疫站贛州341000）

江西省贛州地區(qū)某種鴨場(chǎng)櫻桃谷種鴨發(fā)生一起以產(chǎn)蛋下降、個(gè)別死亡、卵泡出血和肝臟、脾臟表面有白色壞死點(diǎn)為主要特征的疫病，我們?cè)O(shè)計(jì)特異性引物并以建立的PCR、RT-PCR方法對(duì)該病例樣品分別進(jìn)行了禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒、禽多殺性巴氏桿菌、鴨呼腸孤病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、副粘病毒和鴨瘟病毒的檢測(cè)，結(jié)果僅擴(kuò)增出約330 bp大小的鴨坦布蘇病毒特異性條帶和約680 bp大小的鴨呼腸孤病毒特異性條帶，結(jié)合臨床剖檢病變和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，確診該病例為鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病合感染。

鴨坦布蘇病毒病呼腸孤病毒病混合感染診斷

鴨坦布蘇病毒病是2010年4月以來(lái)發(fā)生的一種新鴨病，以采食量迅速下降，產(chǎn)蛋率急劇下降、甚至停產(chǎn)及出現(xiàn)不同程度死亡為主要特征，各品種鴨均有發(fā)生。不同地區(qū)、不同品種鴨群發(fā)病率高低不一，群內(nèi)發(fā)病率幾乎為100%，病死率為5%～15%[1-5]。目前，該病的確診有賴于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)[6]。

鴨呼腸孤病毒病是由呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬番鴨呼腸孤病毒引起番鴨、半番鴨、櫻桃谷鴨、麻鴨等一種病毒性傳染病。該病主要發(fā)生于40日齡內(nèi)番鴨，臨床上以肝、脾、腎表面有白色壞死點(diǎn)為主要病變，其發(fā)病率高，死亡率為10%～50%[7-10]?，F(xiàn)將一例櫻桃谷種鴨發(fā)生鴨坦布蘇病毒病與鴨呼腸孤病毒病混合感染的診斷報(bào)道如下。

1 發(fā)病情況及臨床癥狀

2013年3月，江西省贛州地區(qū)某種鴨場(chǎng)飼養(yǎng)的253日齡、近3 500羽櫻桃谷種鴨突然發(fā)病，采食量明顯下降，患鴨體表、兩腳發(fā)熱，發(fā)病一周后產(chǎn)蛋率從發(fā)病前的89%左右下降到40%，個(gè)別患鴨軟腳或雙腳麻痹，一周內(nèi)死亡種鴨41羽，病死率1.17%。

2 剖檢病變

剖檢病死鴨，主要見(jiàn)肝臟、脾臟表面有數(shù)量不等的白色壞死點(diǎn)，卵泡嚴(yán)重出血，甚至有的卵泡破裂、卵黃液化流入腹腔中。

3 診斷

3.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

3.1.1 病料采集自病死鴨中無(wú)菌采集肝臟（一部分用于細(xì)菌分離）、脾臟和出血卵巢，按常規(guī)方法勻漿，反復(fù)凍融數(shù)次，4℃條件下10 000 r／min離心15 min，無(wú)菌吸取上清液，于220 nm孔徑的濾膜過(guò)濾后于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.1.2 細(xì)菌分離與鑒定用滅菌鉑耳從采集的肝臟樣品中挑取少量樣品，在血瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后將平板倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，未觀察到任何細(xì)菌生長(zhǎng)，則可排除細(xì)菌感染。

3.1.3 病毒檢測(cè)

3.1.3.1 主要試劑RNA提取試劑盒購(gòu)于TIANGEN有限公司（北京）；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑Ribonuclease Inhibitor、DL 2000 DNA Marker等試劑均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒，dNTP Mix、Fast Pfu fly DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

3.1.3.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank提供的禽流感M基因、鴨坦布蘇病毒NS5基因、鴨呼腸孤病毒M3基因、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒PⅧ基因、副粘病毒F基因和鴨瘟病毒UL基因的序列，分別設(shè)計(jì)特異性引物，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

3.1.3.3 核酸提取和病料處理取凍存的病料上清液，分別按病毒RNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)和病毒DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取病料的組織病毒DNA。將其中提取的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（具體操作參照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書(shū)），反轉(zhuǎn)錄的引物為6堿基隨機(jī)引物，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.1.3.4 病毒檢測(cè)從處理好的待檢樣品中，可擴(kuò)增出約330 bp的與預(yù)期大小相符的鴨坦布蘇病毒特異性條帶（見(jiàn)圖1），對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與我國(guó)ZJ 407株，ZJ-6株及ZJ GH-2株鴨坦布蘇病毒NS5基因同源性高達(dá)99%，則確定為鴨群感染鴨坦布蘇病毒病。

另同時(shí)從處理好的待檢樣品中，可擴(kuò)增出約680 bp與預(yù)期大小相符的鴨呼腸孤病毒特異性條帶（見(jiàn)圖2），對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與AVS-B株鴨呼腸孤病毒的同源性最高達(dá)99%，而與919株和S1133株雞源呼腸孤病毒核苷酸同源性較低為86%，則可確定為鴨群也感染鴨呼腸孤病毒病。

圖1 鴨坦布蘇病毒檢測(cè)結(jié)果（1：陽(yáng)性對(duì)照；2：待檢樣品；M：DL2000DNA Marker）

圖2 呼腸孤病毒檢測(cè)結(jié)果（1：陽(yáng)性對(duì)照；2：待檢樣品；M：DL2000DNA Marker）

3.2 診斷根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀和剖檢病變，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，確診該病為鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染。

4 分析與體會(huì)

1）鴨坦布蘇病毒病發(fā)病突然，傳播快速，可感染蛋鴨、種鴨、蛋雞和鵝[11]。在臨床上主要表現(xiàn)為采食量突然大幅下降，產(chǎn)蛋率驟降，由高峰期的90%～95%下降至5%～10%。發(fā)病率可高達(dá)100%。在該病流行的早期，患鴨一般不出現(xiàn)神經(jīng)癥狀；而在流行的后期，神經(jīng)癥狀明顯，表現(xiàn)癱瘓、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)。具有神經(jīng)癥狀的發(fā)病鴨可見(jiàn)腦膜出血，腦組織水腫[12]。

2）呼腸孤病毒病主要發(fā)生于肉鴨，種鴨中很少見(jiàn)到，臨床上以軟腳、腹瀉、生長(zhǎng)障礙為主要癥狀，以肝、脾表面壞死等為主要病變。耐過(guò)鴨生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，成為“僵鴨”。

3）近年來(lái)，養(yǎng)鴨生產(chǎn)中疫病流行常呈現(xiàn)混合感染，兩種甚至多種疫病同時(shí)發(fā)生，通過(guò)臨床表現(xiàn)以及病理變化已難以確診，常需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。由于H5亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、鴨坦布蘇病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、禽I型副黏病毒、呼腸孤病毒等都能引起鴨產(chǎn)蛋下降[13-14]。因此，對(duì)于該病例以設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)其分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果鴨坦布蘇病毒和呼腸孤病毒呈現(xiàn)陽(yáng)性，表明是鴨坦布蘇病毒病與呼腸孤病毒病混合感染，提示呼腸孤病毒在種鴨也有感染。

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B

1003-4331（2014）04-0070-03

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-43）。

劉偉（1989-），男，碩士研究生，從事動(dòng)物病原與分子生物學(xué)研究（E-mail：756149217@qq.com）。

傅光華（1977-），男，副研究員，從事動(dòng)物分子病毒學(xué)研究（E-mail：fuyuan1981@gmail.com）。