顧忠旗，李一峰，郭行磐，陳芋如，周民棟，黃繼，楊金龍

(1．浙江省嵊泗縣海洋科技研究所，浙江舟山，202450;2．上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306)

過(guò)去幾十年間，人類(lèi)活動(dòng)的急劇增加已導(dǎo)致了環(huán)境中重金屬含量不斷上升［1］。銅是軟體動(dòng)物生長(zhǎng)所須的微量元素，但在過(guò)量的情況下其對(duì)生物體具有毒性［2-4］。在自然海洋環(huán)境中，Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度通常低于5 μg/L，而在被污染的海域能高達(dá)800 ～1000 μg/L［5］。海洋中 Cu(Ⅱ)污染的嚴(yán)重性已引起了人們的廣泛關(guān)注和重視。雙殼類(lèi)動(dòng)物不但易于采集，而且對(duì)環(huán)境污染物很敏感并能作出快速的反應(yīng)［6-8］，所以經(jīng)常被用于監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境或養(yǎng)殖水體環(huán)境污染的情況。

厚殼貽貝Mytilus coruscus為中國(guó)重要的貝類(lèi)養(yǎng)殖品種，也是主要的筏式養(yǎng)殖貝類(lèi)之一，其分布于黃海、渤海和東海沿岸［9］，其中以浙江沿海資源量最大。近年來(lái)，人為過(guò)度采捕導(dǎo)致厚殼貽貝自然資源逐漸減少，同時(shí)由于環(huán)境的污染和生態(tài)的破壞，使厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重影響。

有關(guān)Cu(Ⅱ)對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物毒性的研究已有許多報(bào)道，而Cu(Ⅱ)對(duì)厚殼貽貝早期幼蟲(chóng)的急性毒性卻鮮有報(bào)道。為了有效地評(píng)估Cu(Ⅱ)的毒性大小和厚殼貽貝對(duì)Cu(Ⅱ)脅迫的敏感程度，本研究中利用東海區(qū)的常見(jiàn)種厚殼貽貝作為受試生物，研究了不同溫度(10、14、17℃)和Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度 (7．40、32．63、56．58、193．94、300．48 μg/L)的耦合作用對(duì)厚殼貽貝D形幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和存活的影響，旨在為該種的水產(chǎn)養(yǎng)殖提供科學(xué)參考，也為環(huán)境保護(hù)及污染檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1 受試生物 成體厚殼貽貝采自浙江省嵊泗縣枸杞島附近海域，依照Yang等［10］的方法進(jìn)行人工授精和幼蟲(chóng)培育。試驗(yàn)過(guò)程中，使用受精卵孵化后4日齡的D形幼蟲(chóng)，其殼長(zhǎng)為 (81．1±4．2)μm，殼高為 (59．5 ± 4．6)μm。

1．1．2 試驗(yàn)用水及藥品 試驗(yàn)用水取自浙江省嵊泗縣枸杞島海域，鹽度為30，pH為8．11，銨態(tài)氮和亞硝酸氮含量分別為 0．0012、0．0110 mg/L。CuCl2·2H2O(AR)購(gòu)自于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用GF/C濾膜 (Whatman玻璃纖維濾膜，孔徑為1．2 μm)過(guò)濾的海水配制成含Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度為10 mg/L的母液，測(cè)試溶液按要求進(jìn)行稀釋。

1.2 方法

試驗(yàn)在黑暗條件下進(jìn)行，設(shè)制10、14、17℃3個(gè)溫度，每個(gè)溫度下均設(shè)4個(gè)Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度組(10、50、100、300 μg/L)和1個(gè)對(duì)照組，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組，并進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度的測(cè)定采用TAS990原子吸收分光光度計(jì)，實(shí)際測(cè)試質(zhì)量濃度分別為 7．40(對(duì)照)、32．63、56．58、193．94、300．48 μg/L。

(1)存活試驗(yàn)。存活試驗(yàn)在玻璃培養(yǎng)皿 (64 mm×19 mm)內(nèi)進(jìn)行，每一培養(yǎng)皿放入20 mL由滅菌海水配制的Cu(Ⅱ)溶液，隨機(jī)選取20只D形幼蟲(chóng)放入。每隔24 h換水1次，換水后Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度不變，試驗(yàn)過(guò)程中不投餌。

(2)生長(zhǎng)試驗(yàn)。每個(gè)質(zhì)量濃度組放100只幼蟲(chóng)進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)。每隔24 h測(cè)量各質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)的殼長(zhǎng)和殼高，并記錄各組幼蟲(chóng)在1、3、6、10、24、48、72、96 h的死亡數(shù)。幼蟲(chóng)的死亡標(biāo)準(zhǔn)為在顯微鏡下觀察到幼蟲(chóng)靜止不動(dòng)，雙殼張開(kāi)，多次刺激無(wú)反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示 (mean±S．D．)。采用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)單因素和雙因素方差分析 (ANOVA)處理相關(guān)數(shù)據(jù)，顯著性水平設(shè)為0．05。用直線內(nèi)插法計(jì)算厚殼貽貝D形幼蟲(chóng)的半致死濃度 (LC50)，并采用公式SC=0．01 ×96 h LC50計(jì)算安全濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下Cu(Ⅱ)對(duì)D形幼蟲(chóng)存活的影響

10 ℃ 時(shí)，對(duì)照組和 32．63、56．58、193．94 μg/L Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度組，所有幼蟲(chóng)直到10 h均存活且處于游泳狀態(tài)，而300．48 μg/L質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)10 h后存活率顯著下降(P＜0．05)，僅為24%。從圖 1可見(jiàn):Cu(Ⅱ)中暴露 96 h時(shí)，32．63、56．58 μg/L質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)的存活率高于95%，193．94 μg/L質(zhì)量濃度組的存活率僅為3%，而300．48 μg/L質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)在24 h后全部死亡。多重比較結(jié)果表明:193．94 μg/L質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)在96 h時(shí)的存活率較3個(gè)低濃度組顯著下降 (P＜0．05);300．48 μg/L 質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)的存活率較其他濃度組顯著下降 (P＜0．05)。

14℃時(shí)，10 h內(nèi)除300．48 μg/L質(zhì)量濃度組外，對(duì)照組和 32．63、56．58、193．94 μg/L 質(zhì)量濃度組均無(wú)幼蟲(chóng)死亡。在 Cu(Ⅱ)中暴露96 h時(shí)，32．63、56．58 μg/L 質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)全部存活，且呈快速游動(dòng)的狀態(tài);在193．94、300．48 μg/L 質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)的存活率隨著在Cu(Ⅱ)中暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，96 h時(shí)分別為2%和0%。多重比較結(jié)果表明:193．94 μg/L質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)在72 h后的存活率較3個(gè)低濃度組顯著下降 (P＜0．05);300．48 μg/L 質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)的存活率較其他濃度組均顯著下降 (P＜0．05)。

圖1 不同溫度下Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度對(duì)厚殼貽貝D形幼蟲(chóng)存活率的影響Fig.1 Survival rates of mussel Mytilus coruscus larvae exposed to copper(Ⅱ)at different temperature

17 ℃ 時(shí)，10 h 內(nèi)對(duì)照組和 32．63、56．58、193．94 μg/L 質(zhì)量濃度組均無(wú)幼蟲(chóng)死亡，300．48 μg/L質(zhì)量濃度組6 h和10 h時(shí)幼蟲(chóng)的存活率分別降至6%和0%。在Cu(Ⅱ)中暴露96 h時(shí)，32．63 μg/L質(zhì)量濃度組有3%的幼蟲(chóng)死亡，56．58 μg/L質(zhì)量濃度組有近20%的幼蟲(chóng)死亡，193．94 μg/L質(zhì)量濃度組48 h時(shí)的存活率顯著降低 (P＜0．05)，并且在96 h全部死亡。多重比較結(jié)果表明:193．94 μg/L質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)在48 h后的存活率較3個(gè)低濃度組顯著下降 (P ＜0．05);300．48 μg/L質(zhì)量濃度組幼蟲(chóng)的存活率較其他濃度組顯著下降(P ＜0．05)。

Cu(Ⅱ)和溫度的雙因素方差分析結(jié)果表明，96 h后溫度、Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度及其交互作用均極顯著影響幼蟲(chóng)的存活率 (P＜0．05)(表1)。

表1 96 h時(shí)Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度和溫度對(duì)厚殼貽貝D形幼蟲(chóng)毒性影響的雙因子方差分析結(jié)果Tab.1 Two-factor analysis of variance of the effects of copper(Ⅱ)concentration and water temperature on the survival rates of mussel Mytilus coruscus D-veliger larvae in 96 h

根據(jù)幼蟲(chóng)在不同溫度、不同質(zhì)量濃度Cu(Ⅱ)脅迫下的試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算得到Cu(Ⅱ)對(duì)厚殼貽貝D形幼蟲(chóng)的LC50如表2示。從表2可見(jiàn):隨著溫度的升高LC50不斷降低，在48 h時(shí)，17℃組的LC50僅為171．1 μg/L，遠(yuǎn)低于 10、14℃組;在 96 h時(shí)，17℃組的 LC50最小，僅為133．0 μg/L。推算得到，Cu(Ⅱ)脅迫下厚殼貽貝 D形幼蟲(chóng)在10、14、17℃時(shí)的安全濃度 (SC)分別為 14．36、14．35、13．30 μg/L。

表2 厚殼貽貝D形幼蟲(chóng)在不同溫度下的半致死濃度Tab.2 LC50of mussel Mytilus coruscus exposed to copper at different temperatures

2.2 不同溫度下Cu(Ⅱ)對(duì)D形幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的影響

D形幼蟲(chóng)暴露于不同質(zhì)量濃度的Cu(Ⅱ)下，其殼長(zhǎng)的生長(zhǎng)及相對(duì)增長(zhǎng)率分別如圖2和表3所示。從圖2可見(jiàn):17℃時(shí)193．94 μg/L質(zhì)量濃度組暴露72 h后以及10、14、17℃時(shí)300．48 μg/L質(zhì)量濃度組，暴露96 h后幼蟲(chóng)全部死亡，故沒(méi)有幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)生長(zhǎng)的數(shù)據(jù)。從表3可見(jiàn):暴露48 h，10、14、17℃時(shí)不同Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度下幼蟲(chóng)的殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率均無(wú)顯著性差異 (P＞0．05);暴露96 h時(shí)，3種水溫下隨著Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度的增加，幼蟲(chóng)的殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率基本呈下降趨勢(shì)，且在同一質(zhì)量濃度下，17℃ 組幼蟲(chóng)的殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率顯著高于10、14 ℃組(P ＜0．05)，在32．63 μg/L 質(zhì)量濃度下，10、14℃兩組殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率間有顯著性差異 (P＜0．05)，在其他濃度下均無(wú)顯著性差異 (P ＞0．05)。

圖2 不同溫度下Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度對(duì)D形幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響Fig.2 Shell length growth of mussel Mytilus coruscus larvae exposed to copper(Ⅱ)at different temperature

表3 Cu(Ⅱ)暴露下D形幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)的相對(duì)增長(zhǎng)率Tab.3 Relative growth rates in shell length of mussel Mytilus coruscus D-veliger larvae exposed to copper(Ⅱ)at different temperature

3 討論

通常情況下，生物體對(duì)污染物的敏感性取決于生物體的種類(lèi)和該生物體所處的發(fā)育階段［11-12］。Fitzpatrick等［7］研究了Cu(Ⅱ)對(duì)貽貝胚胎發(fā)育、卵子活力和精子的受精能力，結(jié)果表明，胚胎對(duì)Cu(Ⅱ)脅迫最敏感。周光鋒等［13］研究發(fā)現(xiàn)，厚殼貽貝稚貝暴露于溫度為27．2℃的Cu(Ⅱ)水中，其96 h LC50為194 μg/L。本研究中，17℃下厚殼貽貝D形幼蟲(chóng)的LC50為133．0 μg/L，低于厚殼貽貝稚貝的LC50，表明厚殼貽貝幼蟲(chóng)可能對(duì)Cu(Ⅱ)的耐受能力較稚貝弱。同時(shí)，本研究中，17℃時(shí)32．63、56．58 μg/L 質(zhì)量濃度組厚殼貽貝幼蟲(chóng)無(wú)死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，而 Mac Innes等［14］在進(jìn)行不同Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度對(duì)美洲牡蠣Crassostrea virginica幼蟲(chóng)毒性試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，高溫 (20℃)時(shí) 30、60 μg/L Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度下早期幼蟲(chóng)的死亡率分別為2．7%和2．4%，顯著高于厚殼貽貝早期幼蟲(chóng)的死亡率，表明厚殼貽貝早期幼蟲(chóng)對(duì)Cu(Ⅱ)脅迫的耐受力比美洲牡蠣早期幼蟲(chóng)相對(duì)較強(qiáng)。

本研究中，高溫下的幼蟲(chóng)比低溫下幼蟲(chóng)對(duì)Cu(Ⅱ)脅迫更為敏感，尤其是在 193．94 μg/L質(zhì)量濃度下。以往研究表明，在不同水溫條件下，Cu(Ⅱ)脅迫對(duì)美洲牡蠣早期幼蟲(chóng)毒性的影響變化較大［14］。高溫使金屬鹽類(lèi)的溶解度增加，水和溶質(zhì)在細(xì)胞膜內(nèi)外擴(kuò)散速度也相應(yīng)加快［15］。因此，在高溫下，Cu(Ⅱ)對(duì)生物體的毒性有可能較低溫時(shí)高。

溫度是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子。本試驗(yàn)中，研究了幼蟲(chóng)在Cu(Ⅱ)脅迫下的殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率，結(jié)果表明，隨著Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度的升高，在10℃時(shí)，其殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率呈逐漸降低的趨勢(shì)，14℃時(shí)，呈先降低后升高的趨勢(shì)，17℃時(shí)，呈逐漸升高的趨勢(shì);96 h時(shí)高溫組 (17℃)的殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率顯著高于低溫組 (10、14℃)，表明盡管隨著溫度的升高幼蟲(chóng)的LC50下降，但相對(duì)生長(zhǎng)率仍然隨溫度的升高而增大，這可能是隨環(huán)境溫度的升高使其代謝加快所致。

Cairns等［15］認(rèn)為，溫度可以作為一個(gè)反應(yīng)的調(diào)節(jié)器或控制器。溫度的改變可能使某種化合物對(duì)生物體的毒性加強(qiáng)或減弱。因此，溫度的改變，有可能使得最小致死濃度上升或降低，在致死濃度下生物體的存活時(shí)間也會(huì)改變。Cu(Ⅱ)在持續(xù)高溫時(shí)可能對(duì)幼蟲(chóng)的毒性較低溫時(shí)更強(qiáng)，這樣就使生物體更容易超過(guò)其所能耐受的限度，進(jìn)而影響其存活。

綜上所述，在同一水溫下，193．94、300．48 μg/L Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度能顯著降低幼體的存活率并抑制其殼長(zhǎng)生長(zhǎng);在同一Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度脅迫下，高水溫 (17℃)Cu(Ⅱ)暴露組的殼長(zhǎng)相對(duì)增長(zhǎng)率顯著高于低水溫 (10、14℃)組。本研究表明，水溫和Cu(Ⅱ)影響厚殼貽貝早期幼蟲(chóng)的存活和生長(zhǎng)。

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