蔣秀娟 高希梅

1.山東省青州市人民醫(yī)院藥劑科，山東青州 262500;2.北京同仁堂，北京 100010

除濕口服液是我院經(jīng)驗(yàn)處方，為我院皮膚科根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥組方而成，臨床使用多年，療效顯著，副作用小，安全可靠。該制劑處方由苦參、車(chē)前草、艾葉等組成；功能清熱除濕，消腫止癢；主治皮炎、濕疹、瘙癢癥等。為了對(duì)該處方進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，并對(duì)其藥效學(xué)及臨床療效進(jìn)行研究，首先對(duì)該制劑的提取工藝進(jìn)行了研究。

苦參為本方君藥，其主要成分為苦參堿。藥理研究表明，苦參堿具有抗炎、止癢、調(diào)節(jié)免疫功能[1-2]；因此用于治療濕疹等皮膚疾病的市售藥品及醫(yī)院制劑多將苦參堿作為質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[3-4]。本制劑為口服液，故本實(shí)驗(yàn)以苦參堿含量和干浸膏得率為指標(biāo)綜合評(píng)分，應(yīng)用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。選定加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、浸泡時(shí)間作為考察因素，于2013年6月開(kāi)始對(duì)該制劑的提取制備工藝進(jìn)行研究，2014年2月完成實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)總結(jié)研究結(jié)果如下。

1 儀器與試藥

日本島津LC-10AD 高效液相色譜儀；SPD-10A 紫外可見(jiàn)檢測(cè)器；SIL-10A 自動(dòng)進(jìn)樣器；C-R7A 數(shù)據(jù)處理機(jī)；Sartorius BP211D型分析天平；TDX 離心機(jī)。

苦參堿對(duì)照品（批號(hào)110805-200306，中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；所用藥材：苦參、茯苓、車(chē)前草等藥材均購(gòu)自本院中藥房。

甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，考慮劑型因素，選定加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、浸泡時(shí)間作為考察因素。以苦參堿含量和干浸膏得率為指標(biāo)綜合評(píng)分，應(yīng)用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)1 次以計(jì)算誤差。因素水平安排見(jiàn)表1。

表1 水提工藝因素水平表

2.2 干浸膏得率的測(cè)定

精密稱(chēng)取藥材9 份，每份126 g，按L9(34)正交表所列實(shí)驗(yàn)條件煎煮，合并各次水提液，濃縮定容至100 mL。精密移取10 mL，置于已知重量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置烘箱中干燥至恒重，減去皿重，計(jì)算干浸膏得率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 苦參堿的含量測(cè)定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-氨水（52：45：3）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：50℃。

2.3.2 線性范圍考察 精密稱(chēng)取苦參堿對(duì)照品10.20 mg，置于10 mL容量瓶中加甲醇定容，配成1.02 mg/mL 的溶液，取此對(duì)照品溶液50 μL，稀釋至1mL，即濃度為0.051 mg/mL 的對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液10、20、30、40、50 μL 注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=588712.7X-1254.9，r=0.9999。結(jié)果表明：苦參堿在0.51～2.55 μg 內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.3 樣品供試液的制備 精密量取定容后的水提液10 mL，精密加入濃氨試液2 mL（調(diào)節(jié)pH 9～11），搖勻，精密加入二氯甲烷30 mL，振搖提取后3000 r/min 離心5 min，精密吸取下層溶液5 mL，于蒸發(fā)皿中水浴揮干溶劑，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL 容量瓶?jī)?nèi)定容，搖勻，0.22 μm 濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.3.4 測(cè)定方法 精密吸取樣品供試液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，代入回歸方程，計(jì)算樣品中苦參堿含量，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析采用SPSS 10.0 軟件，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析表

2.4 結(jié)果

由表2 的R 值和表3 的F 值可以看出，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要性為C>A>B>D。方差分析結(jié)果表明，A、B、C 因素對(duì)結(jié)果有極顯著意義（P＜0.01），D 因素?zé)o意義（P>0.05）。最佳水提工藝應(yīng)該采用A1B3C3D3，即加8 倍量水，浸泡3 h，煎煮4 次，每次2 h。該工藝與正交試驗(yàn)中的3 號(hào)試驗(yàn)工藝完全相同，該方案平行2 次的試驗(yàn)中浸膏得率分別為15.75%、16.73%；苦參堿含量分別為1.263 mg/g、1.104 mg/g，均明顯高于其它方案的得率。從表2 中影響因素D（浸泡時(shí)間）的R 值僅為0.401，遠(yuǎn)小于其它因素；表3 中因素D 的顯著性分析為0.149，P>0.05，說(shuō)明浸泡時(shí)間對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，因此為節(jié)省工時(shí)，最終確定該制劑的提取工藝為藥材不浸泡，直接加8 倍量水，煎煮4 次，每次2 h。

3 討論

①苦參是中醫(yī)治療各種皮膚疾患的常用藥材，也是本方君藥。本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)以苦參堿和浸膏得率為指標(biāo)，對(duì)水提工藝進(jìn)行優(yōu)選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明浸泡時(shí)間對(duì)浸膏得率及苦參堿含量影響不大，分析可能與苦參藥材質(zhì)地較疏松，以及處方藥材多為葉類(lèi)、花草等輕質(zhì)藥材有關(guān)[5]。故為生產(chǎn)過(guò)程中節(jié)約工時(shí)及能耗考慮，最終確定藥材不浸泡，直接加8 倍量水，煎煮4 次，每次2 h 的最佳提取方案。并在中試研究中以此方案獲得合格的中試產(chǎn)品。

②分析表2 數(shù)據(jù)可見(jiàn)，不同提取工藝條件下測(cè)得苦參堿含量0.601～1.263 mg/g，處方中的主要藥效指標(biāo)在優(yōu)化條件下可以提高1 倍，充分說(shuō)明對(duì)提取工藝篩選的必要性。

③本研究過(guò)程中曾試驗(yàn)以藥材中苦參堿與氧化苦參堿的總量作為定量指標(biāo)[6]，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)因苦參堿與氧化苦參堿在加熱過(guò)程中存在互相轉(zhuǎn)化，以此綜合指標(biāo)測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，且多數(shù)研究文獻(xiàn)表明苦參堿是苦參中抗炎、止癢[1-2]的主要藥效成分，故最終以苦參堿含量作為測(cè)定指標(biāo)。

④處方中另有車(chē)前草等藥材也是清熱利濕的主要組分，但是因條件所限在本研究中未能對(duì)車(chē)前草的指標(biāo)性成分進(jìn)行測(cè)定，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立中應(yīng)考慮對(duì)該藥材進(jìn)行鑒別或定量分析。

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