郭 麗,解 軍
(1.臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山西 臨汾 041000,2.山西醫(yī)科大學(xué),山西 太原 030001)
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是在基因組核苷酸基礎(chǔ)上出現(xiàn)變異而引起的DNA序列多態(tài)性,有單堿基的變換、顛倒以及插入或缺失等。在基因組中平均每1 000 bp就約有一個(gè)SNP。SNP與致病基因的搜查、種群多樣性的研究,特別是與人類的遺傳特征密切相關(guān),因此,SNP可廣泛用于診斷學(xué)和治療學(xué)。
神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTDs)是神經(jīng)管在胚胎發(fā)育過程中因閉合不全而引起的一種先天性缺陷性疾?。?]。顱骨閉合失敗導(dǎo)致無腦畸形,是常見的致死原因;尾端閉合失敗通常導(dǎo)致脊髓脊膜膨出。NTDs是最常見的出生缺陷,該病的發(fā)病機(jī)制受到遺傳、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)等多種因素共同作用,是交互影響而導(dǎo)致的結(jié)果,其中遺傳因子的作用更為突出。神經(jīng)管畸形可導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、死亡及新生兒死亡等嚴(yán)重后果,山西省發(fā)病率高達(dá)10‰[2],嚴(yán)重影響新生兒的生存質(zhì)量。在受孕前給母親補(bǔ)充葉酸能夠減低NTDs的風(fēng)險(xiǎn)。
葉酸衍生物是DNA的合成、細(xì)胞分裂、膜的生長(zhǎng)、DNA甲基化所必需的,甲基化能在基因表達(dá)、染色體結(jié)構(gòu)的維持中發(fā)揮作用,恰恰它們也正是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提示葉酸鹽的補(bǔ)充能對(duì)抗顱面畸形、神經(jīng)管畸形的發(fā)生。
本研究通過檢測(cè)樣本的還原性葉酸載體(reduced folate carrier,RFC)基因多態(tài)性,預(yù)測(cè)了其蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),分析了其基因分型及頻率與神經(jīng)管畸形發(fā)生之間的相關(guān)性,為今后制定神經(jīng)管畸形有效的預(yù)防和篩查方案提供一定的科學(xué)依據(jù)。
選取2012年3月~2013年12月在山西省臨汾市第一人民醫(yī)院、兒童醫(yī)院產(chǎn)科門診進(jìn)行產(chǎn)前檢查的妊娠婦女539名。確診孕有神經(jīng)管畸形兒的30名孕婦為病例組,同一時(shí)期正常妊娠的健康孕婦509名為對(duì)照組,兩組對(duì)象基本情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表1 兩組基本情況對(duì)比表Table 1 Comparison of Basic Condition between the Case and the Control Groups
1.2.1 采集樣本 本研究對(duì)象抽取2 mL空腹靜脈血,并進(jìn)行抗凝處理。
1.2.2 提取 DNA 購(gòu)買BioDev試劑盒,按照說明逐步從血液中提取DNA,保存在-20℃。
1.2.3 基因分型 由 TAKARA公司對(duì) RFC-1基因A80G位點(diǎn)進(jìn)行基因測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分型,并對(duì)其分析。
應(yīng)用Swiss Pdb viewer4.0軟件對(duì)比分析野生型與突變型RFC-1三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析。
使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用χ2檢驗(yàn)對(duì)RFC-1 A80G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率的差異進(jìn)行比較,Logistic回歸分析計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度(odds ratio,OR值)和95%可信區(qū)間(95%CI),提示各基因型發(fā)生神經(jīng)管畸形的風(fēng)險(xiǎn)。
根據(jù)RFC-1基因的外顯子3的第80位出現(xiàn)一個(gè)高頻G-A的點(diǎn)突變,使得氨基酸由精氨酸轉(zhuǎn)化為組氨酸。預(yù)測(cè)突變結(jié)果可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1。
表2 兩組RFC-1基因分型及等位基因頻率的比較Table 2 Comparison of RFC-1 Gene Polymorphisms and Allele Frequency between the Case and Control Groups
RFC-1 80位基因型分布頻率為神經(jīng)管畸形兒孕婦組 AA15(50.0%),AG10(33.3%),GG5(16.7%),對(duì)照組 AA40(80.0%)AG8(16.0%),GG2(4.0%),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.386,P <0.05)。等位基因?yàn)樯窠?jīng)管畸形兒孕婦組 A39(65.0%),G21(35.0%),對(duì)照組 A88(88.0%),G12(12.0%),組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.117,P <0.05)。
RFC-1 80位與神經(jīng)管畸形相關(guān)性分析:RFC-1 80位與AA基因型相比較,G等位基因和GG基因型的孕婦發(fā)生NTDs的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)明顯增加,分別為3.567,95%CI(1.923 ~ 5.976),OR=6.101,95% CI(1.331 ~21.609),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。
圖1 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 Predicted Results of A Three- dimensional Model
在我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查中,山西省神經(jīng)管畸形的發(fā)病率居全國(guó)首位,嚴(yán)重影響新生人口質(zhì)量,制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展,雖對(duì)孕婦進(jìn)行孕期監(jiān)測(cè)可以降低患兒出生率,但仍不能徹底消除。本研究從遺傳學(xué)角度入手,以孕育神經(jīng)管畸形兒的孕婦為病例組,孕育正常兒的孕婦為對(duì)照組,采取基因測(cè)序的辦法[3],對(duì)RFC-1基因在80位點(diǎn)由A-G突變進(jìn)行了相關(guān)性研究,并對(duì)三維空間構(gòu)象進(jìn)行了分析。
研究發(fā)現(xiàn),小量葉酸可以限制細(xì)胞分裂為甲硫氨酸的代謝,以增加孕婦機(jī)體血清中高半胱氨酸的含量。A80G是RFC-1常見的突變位點(diǎn),它的突變直接或間接的影響基因活性降低,葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷,從而引起與葉酸代謝相關(guān)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的加大。RFC基因是在小腸組織中表達(dá)的葉酸載體,是葉酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中必不可少的。當(dāng)葉酸在小腸中吸收時(shí),主要通過RFC途徑完成。若RFC-1基因出現(xiàn)點(diǎn)突變,會(huì)導(dǎo)致精氨酸轉(zhuǎn)化為組氨酸,改變其代謝途徑,從而影響葉酸的吸收效率。
本研究結(jié)果顯示,病例組 GG基因型頻率(16.7%)顯著高于對(duì)照組(4.0%),且 OR 值為 6.101,提示發(fā)生NTDs的風(fēng)險(xiǎn)明顯增大。說明在山西漢族人群中,RFC-1基因A80G多態(tài)性時(shí)發(fā)生NTDs的風(fēng)險(xiǎn)因素高。若能在懷孕前進(jìn)行RFC-1基因A80G的多態(tài)性篩查,并及時(shí)在受孕前后給予GG基因型婦女口服足量的葉酸,可降低NTDs的發(fā)生率。
本次研究樣本收集的例數(shù)較少,有一定的局限性,但本研究提供的數(shù)據(jù)表明了RFC-1和神經(jīng)管畸形之間有相關(guān)性,葉酸代謝途徑異常在NTDs中有重要作用,應(yīng)該作為神經(jīng)管畸形研究的潛在危險(xiǎn)因素。
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