楊修仕，周閑容，王麗君，于曉娜，4，石振興，任貴興，*，董 川

(1.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西太原030006;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京100081; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193;4.齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東濟南250353)

西洋參(Panax quinquefolius L.)，又名花旗參或廣東人參，為五加科人參屬植物。西洋參原產(chǎn)于美國北部到加拿大南部一帶，在我國黑龍江、吉林、遼寧、陜西等地已有較大量栽培［1］。西洋參富含皂苷、多糖等生物活性物質(zhì)，具備多種生理功效。西洋參根中含有約6%～10%的多糖，其具有增強免疫、抗流感、抗腫瘤等生理作用［2－5］。多糖的生理活性取決于其分子量大小、單糖組成、糖苷鍵等分子結(jié)構(gòu)特征［6－8］。超濾作為一種新型的膜分離技術(shù)，具有設(shè)備簡單、選擇性高、能耗低等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于多糖、蛋白等熱敏性物質(zhì)的分離與純化［9－11］。但應(yīng)用超濾膜分離技術(shù)對西洋參多糖進行分離純化的研究鮮見報道。本研究采用超濾技術(shù)，對西洋參根水提物進行分離，通過考察不同分子量段西洋參多糖的免疫增強活性，選擇純化具有免疫活性的西洋參多糖組分，以期為開發(fā)西洋參多糖保健食品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參干燥根 黑龍江東渡參業(yè)有限公司，4年生;無水乙醇、苯酚、硫酸、吡啶、三氟乙酸 國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司，分析純;甲醇 Merck公司，色譜純;六甲基二硅氮烷、三甲基氯硅烷 Fluka公司;單糖對照品、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、脂多糖(LPS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、Griess試劑 Sigma－A ldrich公司;青霉素、鏈霉素、胎牛血清 GE Healthcare Bio－Sciences公司;小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW 264.7) 中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫;腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白介素－6(IL－6)及白介素－10(IL－10)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

WK－400A小型高速粉碎機 山東青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司;Amicon Stirred Cell Ultrafitration 8400超濾系統(tǒng) 德國Merck Millipore公司;VirTis冷凍干燥機 美國 SP Scientific公司; Agilent 6890氣相色譜 美國Agilent公司;CB－53二氧化碳培養(yǎng)箱 德國 BINDER公司;Multiskan Spectrum酶標儀 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西洋參多糖的提取 西洋參多糖的提取參照任燁等［1］和于榮敏等［12］的方法，并做適當修改。采用高速粉碎機對西洋參干燥根進行破碎，并過60目篩。稱取適量西洋參粉末于錐形瓶中，加入14倍量75%的乙醇，置于45℃水浴鍋中，攪拌提取5h，以除去西洋參中的皂苷、脂類、色素等醇溶性成分。過濾，濾渣重復(fù)提取一次，收集濾渣，60℃烘干至恒重。稱取適量烘干濾渣于錐形瓶中，加入14倍量的蒸餾水煮沸4h，于3800 r/m in離心10m in，分離上清和沉淀。沉淀重復(fù)提取1次，合并2次提取液，備用。

1.2.2 不同分子量段西洋參多糖的制備 西洋參多糖的超濾分離參照Lemmon等［13］和姚瑞祺等［14］的方法，并做適當修改。依次用5、1.2、0.45μm微濾膜除去西洋參多糖提取液中的固形物以降低對超濾膜的污染?？刂瞥瑸V壓力為0.08MPa，分別用分子截流量為100、30、10ku的超濾膜，將粗提物按分子量大小分為＞100ku(AGP1)、30～100ku(AGP2)、10～30ku(AGP3)和＜10ku(AGP4)四部分，冷凍干燥，稱重，計算得率。各分子量段多糖所占的百分比按下式計算:

式中:W1為各分子量段多糖的質(zhì)量;W0為四部分多糖的質(zhì)量之和。

1.2.3 總糖含量測定 采用苯酚－硫酸法測定AGP1～AGP4中的總糖含量［15］。

1.2.4 單糖組成分析 單糖組成分析參照Yu等［16］和Guentas等［17］的方法，并做適當修改。稱取AGP1～AGP4樣品10mg，加入適量2mol/L的三氟乙酸，于120℃水解4h，冷卻至室溫，氮氣吹干。依次加入1m L吡啶、0.4m L六甲基二硅氮烷、0.2m L三甲基氯硅烷，充分混勻，室溫下反應(yīng)5m in，并于1000 r/m in離心10min。取上清液進行氣相分析。氣相條件為: HP－5 MS毛細管柱(0.25mm×30m×0.25μm);不分流模式;后進樣口溫度，250℃;氫火焰離子化檢測器溫度，260℃;升溫程序為100～150℃(5℃/m in)，保持5m in，150～240℃(5°C/m in)，保持3m in;載氣為氮氣，流速40.0m L/min;空氣流速400m L/m in，氫氣流速40m L/m in。

1.2.5 NO生成的測定 通過測定體外培養(yǎng)的巨噬細胞上清液中亞硝酸鹽含量來表征其NO生成［18］。在無菌條件下將AGP1～AGP4用PBS溶解備用。將處于對數(shù)生長期的巨噬細胞調(diào)整密度為7.5×105個/m L，分為空白組(只含培養(yǎng)基)、實驗組(1、10、50、100、300μg/m L的AGP1～AGP4)和陽性對照組(1μg/m L的LPS)，于5%CO2濃度、37℃條件下培養(yǎng)24h。分別取各組上清液 50μL，加入 Griess試劑50μL，室溫下反應(yīng)15m in，于540nm測定吸光度。以NaNO2為對照品，繪制標準曲線，得到回歸方程為: y=0.007x+0.002，R2=0.9990。計算上清液中的亞硝酸鹽含量。

1.2.6 細胞因子生成的測定 將處于對數(shù)生長期的巨噬細胞調(diào)整密度為7.5×105個/m L，分為空白組(只含培養(yǎng)基)、實驗組(1、50、150μg/m L的AGP1～AGP4)和陽性對照組(1μg/m L的LPS)，于5%CO2濃度、37℃條件下培養(yǎng)24h。收集各組上清液，按照試劑盒標注方法，對TNF－α、IL－6及IL－10進行測定。于450nm和570nm雙波長下測定吸光度值，繪制標準曲線，得到TNF－α、IL－6及IL－10的回歸方程分別為:y=0.001x－0.018，R2=0.9953;y=0.001x+0.091，R2=0.9943;y=0.001x+0.029，R2=0.9925。計算上清液中的細胞因子的含量。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 19.0進行方差分析，數(shù)值以均值±標準差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量段西洋參多糖得率及其總糖含量和單糖組成

不同分子量段西洋參多糖的得率及單糖組成結(jié)果見表1。由表1可知，西洋參粗多糖的總得率(AGP1～AGP4之和)較低，為5.17%，一方面可能與提取工藝有關(guān)，另一方面，種植條件也可能造成西洋參原料含有的多糖本來就較少。四段多糖中，分子量＞100ku的部分(AGP1)所占比例最高，約為46.61%，分子量為30～100ku的部分(AGP2)所占比例最低，約為 3.30%，分子量為 10～30ku的部分(AGP3)和分子量＜10ku的部分(AGP4)所占比例分別為12.11%和37.98%。各分子量段多糖的總糖含量存在一定差異，AGP1的總糖含量最高，為56.55%，AGP4的總糖含量最低，為42.87%。四段多糖分別由6～8種單糖組成，均含有阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸。但不同分子量段多糖的單糖比例各不相同，其中，AGP1含有較多的甘露糖，AGP2含有較多的半乳糖和葡萄糖，AGP3含有較多的半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，AGP4含有較多的葡萄糖和葡萄糖醛酸。

2.2 西洋參多糖對巨噬細胞NO生成的影響

NO作為一種多功能的內(nèi)源性生物信息分子，其在免疫系統(tǒng)的多種生理過程中均發(fā)揮著重要作用，是巨噬細胞發(fā)生免疫激活反應(yīng)的重要因子［19］。不同分子量段西洋參多糖體外刺激巨噬細胞NO生成的實驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，與空白對照組相比，AGP1與AGP2具有良好的刺激巨噬細胞NO生成的活性，AGP3與AGP4的活性不明顯。在1～50μg/m L濃度范圍內(nèi)，AGP1的活性隨著濃度的增加而迅速增強，濃度達到50μg/m L后，活性增加的速度減緩。AGP2的活性在1～50μg/m L濃度范圍內(nèi)也呈現(xiàn)迅速增強，且在50μg/m L時達到最強，隨后略有降低。在10μg/m L的濃度下，AGP2的活性顯著高于 AGP1 (p＜0.05)，但在其他濃度下，兩者的活性不存在顯著差異(p＞0.05)。當AGP1和AGP2的濃度分別達到50μg/m L和10μg/m L以上時，二者對巨噬細胞NO生成的促進作用與陽性對照之間無顯著差異。

表1 不同分子量段西洋參多糖的得率及其總糖含量和單糖組成Table1 Yield，total sugar content and monosaccharide composition of American ginseng polysaccharides in differentmolecular weight range

圖1 不同分子量段西洋參多糖對巨噬細胞NO生成的影響Fig.1 Effect of American ginseng polysaccharide in differentmolecular weight range on NO production ofmacrophages

2.3 西洋參多糖對巨噬細胞TNF－α生成的影響

巨噬細胞被激活后，迅速表達各種細胞因子，介導(dǎo)宿主細胞的免疫反應(yīng)，進而增強機體免疫能力。由圖2可知，與空白對照相比，AGP1與AGP2可促進巨噬細胞TNF－α的生成，AGP3與AGP4的促進作用不明顯。在1～150μg/m L濃度范圍內(nèi)，AGP1與AGP2的活性均隨濃度增加而增強，且二者在相同濃度下的活性不存在顯著差異。但AGP2在相同濃度下刺激巨噬細胞產(chǎn)生的 TNF－α的濃度值均略高于AGP1。當AGP1和AGP2的濃度達到150μg/m L時，二者對巨噬細胞TNF－α生成的促進作用與陽性對照之間無顯著差異。不同分子量段西洋參多糖促進巨噬細胞TNF－α生成的實驗結(jié)果與2.2中促進NO生成的結(jié)果較為一致。

圖2 不同分子量段西洋參多糖對巨噬細胞TNF－α生成的影響Fig.2 Effect of American ginseng polysaccharide in differentmolecular weight range on TNF－αproduction ofmacrophages

2.4 西洋參多糖對巨噬細胞IL－6生成的影響

圖3 不同分子量段西洋參多糖對巨噬細胞IL－6生成的影響Fig.3 Effect of American ginseng polysaccharide in differentmolecular weight range on IL－6 production ofmacrophages

西洋參多糖體外刺激巨噬細胞IL－6生成的實驗結(jié)果見圖3。由圖3可知，與空白對照組相比，AGP1與AGP2可促進巨噬細胞IL－6的生成，AGP3與AGP4幾乎無促進作用。在1～150μg/m L濃度范圍內(nèi)，AGP1與AGP2的活性均隨濃度增加而增強，同時，二者的活性在相同濃度下均不存在顯著差異。但AGP2在相同濃度下刺激巨噬細胞產(chǎn)生的IL－6的濃度值均略高于AGP1。當AGP1和AGP2的濃度達到150μg/m L時，二者對巨噬細胞IL－6生成的促進作用與陽性對照之間無顯著性差異。不同分子量段西洋參多糖促進巨噬細胞IL－6生成的結(jié)果與2.3中促進TNF－α生成的結(jié)果一致。

2.5 西洋參多糖對巨噬細胞IL－10生成的影響

西洋參多糖體外刺激巨噬細胞IL－10生成的實驗結(jié)果見圖4。由圖4可知，與空白對照組相比，AGP1與AGP2可促進巨噬細胞IL－10的生成，而AGP3與AGP4幾乎無促進作用。在1～150μg/m L濃度范圍內(nèi)，AGP1與AGP2的活性均隨濃度增加而增強。但從IL－10生成值來看，AGP2在相同濃度下刺激巨噬細胞產(chǎn)生的IL－10的濃度值均略高于AGP1。當AGP1和AGP2的濃度達到150μg/m L時，二者對巨噬細胞IL－10生成的促進作用與陽性對照之間無顯著性差異。不同分子量段西洋參多糖促進巨噬細胞IL－10生成的結(jié)果與其促進TNF－α及IL－6生成的結(jié)果一致。

圖4 不同分子量段西洋參多糖對巨噬細胞IL－10生成的影響Fig.4 Effect of American ginseng polysaccharide in differentmolecular weight range on IL－10 production ofmacrophages

3 討論

機體免疫力的降低容易導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。如何提高機體免疫力是科學(xué)界的一個研究熱點。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對西洋參多糖的免疫活性進行了研究，證實了西洋參多糖可促進巨噬細胞多種細胞因子的表達，具有免疫增強作用［2－3，5］。但相關(guān)研究多以西洋參中的全部分子量范圍的多糖為研究對象，缺乏對不同分子量段范圍多糖的免疫活性研究。

膜分離技術(shù)近年來已廣泛應(yīng)用于多糖、蛋白等大分子的分離純化。本研究采用超濾法分離得到四種不同分子量段的西洋參多糖，四者的單糖組成存在一定差異。朱麗娜等［9］采用超濾法從蛹蟲草分離得到的免疫活性最強多糖組分的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，且甘露糖約占57.6%。本研究中，AGP1也含有此6種單糖組分，其甘露糖含量較高，且表現(xiàn)出了較強的免疫活性。因此，我們推測，含有類似單糖組成，且甘露糖含量較高的多糖可能具有較強的免疫活性。

除單糖組成外，多糖的免疫調(diào)節(jié)活性與其分子量也密切相關(guān)。本研究中得到的西洋參多糖分子量不同，其免疫活性也應(yīng)存在差異。通過測定巨噬細胞NO及細胞因子生成，我們發(fā)現(xiàn)不同分子量段西洋參多糖的免疫活性確實存在較大差異。分子量大于100ku(AGP1)以及分子量在30～100ku(AGP2)的西洋參多糖均表現(xiàn)出刺激巨噬細胞NO、TNF－α、IL－6及IL－10生成的活性。但分子量小于30ku的西洋參多糖(AGP3與AGP4)均未表現(xiàn)出免疫增強活性。朱麗娜等［9］和楊陽等［10］的研究表明，分子量大于100ku的多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性。本研究也表明，分子量大于100ku的的多糖具有免疫增強活性，且其所占比例達46.61%。同時，我們還發(fā)現(xiàn)分子量在30～100ku的西洋參多糖具有更強的促進巨噬細胞生成NO和細胞因子的活性。

本研究采用超濾技術(shù)得到具有免疫活性的不同多糖組分，并未針對提取液進行除淀粉和除蛋白等工藝處理，因此得到的多糖組分中可能含有部分淀粉和蛋白。淀粉通常不具有顯著的免疫增強作用，而多糖組分中的蛋白是否具有免疫增強活性還有待進一步研究。但在開發(fā)保健食品時，若此部分蛋白有免疫增強活性，則無需將其從組分中分離。

4 結(jié)論

采用超濾分離得到四個不同分子量段的西洋參多糖組分，總糖含量及單糖組成分析表明四者總糖含量及單糖組分均存在一定差異。免疫增強活性研究表明，分子量大于30ku的西洋參多糖的具有較強的刺激巨噬細胞NO、TNF－α、IL－6及IL－10生成的活性。本研究采用超濾技術(shù)選擇純化具有免疫活性的西洋參多糖組分，相關(guān)結(jié)果可為西洋參多糖增強免疫類保健食品的開發(fā)提供理論支撐。

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