蔣照輝　李和明　蔣軍輝等

[摘要] 目的 腫瘤多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因，肺耐藥蛋白（LRP）可誘導(dǎo)多藥耐藥，我們研究雄激素對前列腺癌的LRP表達(dá)影響。 方法 人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP及PC-3在含多西他賽的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)成為耐藥細(xì)胞株，耐藥細(xì)胞株分別在含有DHT培養(yǎng)液和在含DHT及比卡魯胺培養(yǎng)液中培養(yǎng)7d。免疫細(xì)胞化學(xué)及Western Blot檢測兩組細(xì)胞的LRP表達(dá)。 結(jié)果 LRP在LNCaP及PC-3細(xì)胞系的表達(dá)明顯低于LNCaP/Docetaxel及PC-3/Docetaxel細(xì)胞系，DHT誘導(dǎo)后，LNCaP/Docetaxel及PC-3/Docetaxel細(xì)胞系的LRP表達(dá)明顯增加，經(jīng)DHT及比卡魯胺聯(lián)合作用后，LRP的表達(dá)明顯低于DHT誘導(dǎo)后。 結(jié)論 多西他賽可誘導(dǎo)前列腺癌LRP表達(dá)， 二氫睪酮可誘導(dǎo)耐多西他賽前列腺癌的LRP增量表達(dá)，雄激素受體阻斷劑比卡魯胺可阻斷二氫睪酮的誘導(dǎo)作用。

[關(guān)鍵詞] 雄激素；前列腺癌；多藥耐藥；肺耐藥蛋白

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）04-0017-03

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為發(fā)病率最高的惡性腫瘤，雖然我國前列腺癌的發(fā)病率低于歐美國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢。

內(nèi)分泌治療是晚期前列腺癌的主要治療方法，大多數(shù)前列腺癌患者起初對內(nèi)分泌治療均有效，但經(jīng)過中位時間14～30個月后，幾乎所有前列腺癌都將逐漸發(fā)展為激素難治性前列腺癌。目前以多西他賽為基礎(chǔ)的化療已經(jīng)成為激素難治性前列腺癌標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案，病情緩解期為4～10個月，中位數(shù)生存時間為9～18個月。腫瘤多藥耐藥是腫瘤化療失敗的主要原因，肺耐藥蛋白（LRP）是目前研究較多的腫瘤耐藥相關(guān)蛋白，但在前列腺癌中的表達(dá)只有很少報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP及PC-3（中科院上海細(xì)胞庫），RPMI-1640培養(yǎng)液（Sigma 公司），LRP抗體IgG（Santa Cruz公司），PVDF膜（Millipore公司）， 多西他賽（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，批號201209304），二氫睪酮DHT（Sigma 公司），比卡魯胺（康為世紀(jì)公司）。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1雄激素對耐多西他賽難治性前列腺癌細(xì)胞株的誘導(dǎo) 人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP及PC-3分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 mg/L的RPMI-1640培養(yǎng)液中， 0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集生長旺盛的細(xì)胞用于實驗。含多西他賽濃度0.8μg/mL（1/5治療劑量的血藥濃度），與LNCaP及PC-3細(xì)胞共同培養(yǎng)7 d，每7天增加多西他賽濃度0.8μg/mL， 直至在含多西他賽濃度4μg/mL（正常治療劑量的血藥濃度）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞能穩(wěn)定生長傳代，建立LNCaP及PC-3耐多西他賽細(xì)胞系（LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel）。將LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel分為兩組，一組細(xì)胞在含有100nmol/L DHT的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)7d建立LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT細(xì)胞株，另一組在含100nmol/L DHT及1μg/L比卡魯胺RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)7d建立LNCaP/docetaxel-DHT-比卡魯胺及PC-3/Docetaxel-DHT-比卡魯胺細(xì)胞株。

1.2.2 LRP的免疫細(xì)胞化學(xué) 將LNCaP及PC-3、LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel、LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT、LNCaP/docetaxel-DHT-比卡魯胺及PC-3/Docetaxel-DHT-比卡魯胺分別接種于盛有蓋玻片的24孔板中，細(xì)胞爬滿蓋玻片后，取出蓋玻片用4%多聚甲醛4℃固定15min，PBS洗3次，20%正常羊血清室溫孵育30min，分別加入LRP鼠單克隆抗體IgG（1∶1000），37℃ 2h，PBS 洗3次，EnVision試劑（HRP/R）37℃30min，DAB顯色12min，蘇木精染色，樹脂封片；顯微鏡下觀察，背景呈紫藍(lán)色，陽性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。圖像應(yīng)用圖像分析軟件分析。

1.2.3 Western Blot 檢測LRP表達(dá) 用蛋白裂解液于冰浴裂解LNCaP及PC-3、LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel、LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT、LNCaP/docetaxel-DHT-比卡魯胺及PC-3/docetaxel-DHT-比卡魯胺細(xì)胞15min，14 000 ×g，離心15min。取上清液移入新的離心管中-80℃保存待用。取少量上清按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟進(jìn)行定量。100℃煮沸變性10min，冰浴5min后上樣。取出上樣至0.5mL進(jìn)行電泳，電泳時間一般4h，電壓60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。取下PVDF膜，置于濕盒中用5%BSA封閉2h，加入LRP鼠單克隆抗體（1∶1000），4℃搖床過夜，PBS洗15min×3，加入兔抗鼠二抗（1∶5000），室溫，反應(yīng)1h，混合等體積化學(xué)發(fā)光劑AB液，放射自顯影，放入Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀檢測結(jié)果定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，等級資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LRP表達(dá)細(xì)胞免疫結(jié)果

LRP主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿，LNCaP及PC-3細(xì)胞系LRP的表達(dá)強度為+（15/100、9/100），明顯低于LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細(xì)胞系表達(dá)強度++（45/100、38/100）（χ2=6.134，P=0.043；χ2=5.367，P=0.048）；DHT誘導(dǎo)后LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細(xì)胞系LRP的表達(dá)強度為+++（78/100、70/100）（χ2=7.456，P=0.031；χ2=7.123，P=0.034），比卡魯胺阻斷DHT后LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細(xì)胞系LRP的表達(dá)強度++（42/100、22/100）（χ2=7.986，P=0.028；χ2=7.363，P=0.030）。

2.2 Western blot 結(jié)果

LRP在LNCaP及PC-3細(xì)胞系的表達(dá)明顯低于LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細(xì)胞系，DHT誘導(dǎo)后， LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel細(xì)胞系的LRP表達(dá)明顯增加，經(jīng)DHT及比卡魯胺聯(lián)合作用后，LRP的表達(dá)明顯低于DHT誘導(dǎo)后（圖1）。

3 討論

近年來我國前列腺癌的發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)為晚期，雄激素阻斷是晚期前列腺癌的主要治療方法，起初大多數(shù)患者對雄激素阻斷治療有效，但經(jīng)過14～30個月后，幾乎所有患者病變都將逐漸發(fā)展為激素難治性前列腺癌。目前以多西他賽為基礎(chǔ)的化療已經(jīng)成為激素難治性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案，但化療的有效緩解期為4～10個月，并逐漸發(fā)展為對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥，從而導(dǎo)致治療失敗。

腫瘤出現(xiàn)多藥耐藥的原因為腫瘤本身固有的耐藥現(xiàn)象和經(jīng)化療藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥能力。肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）是Scheper等[1]在肺癌中首先發(fā)現(xiàn)，LRP過度表達(dá)在許多實體腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)[2-4]。LRP在細(xì)胞中參與藥物的囊泡運輸，可把細(xì)胞核內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運至核外，形成囊泡包裹藥物，使化療藥物不能發(fā)揮作用，并胞吐排出細(xì)胞，從而介導(dǎo)多種化療藥物的耐藥。Kerr 等[5]報道LRP高表達(dá)容易導(dǎo)致卵巢漿液性癌對卡鉑耐藥。Tsuji報道LRP的表達(dá)是白血病母細(xì)胞誘導(dǎo)化療抵抗的一個危險因素，抑制LRP表達(dá)可有效增加化療效果[6]。律潔等[7]報道抑制A549/DDP細(xì)胞中Src酪氨酸激酶活性可降低細(xì)胞LPP表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性。李祥春等[8]報道塞來昔布可以下調(diào)胃癌細(xì)胞株中耐藥基因LRP的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。

劉津等[9]報道人鼻咽癌多藥耐藥細(xì)胞株LRP在蛋白水平及mRNA水平的表達(dá)高于親本細(xì)胞，表明LRP的表達(dá)上調(diào)與其耐藥機制有密切關(guān)系。韓冰等[10]報道氟尿苷耐藥絨癌細(xì)胞系LRP基因的表達(dá)隨著誘導(dǎo)藥物濃度和腫瘤細(xì)胞耐藥性的增加而逐漸上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)LNCaP及PC-3前列腺癌細(xì)胞株均有不同水平的LRP表達(dá)，而經(jīng)過多西他賽誘導(dǎo)后LRP表達(dá)明顯增加。我們的結(jié)果提示多西他賽治療一段時間后，可誘導(dǎo)耐藥蛋白LRP表達(dá)，從而使前列腺癌細(xì)胞獲得繼發(fā)性耐藥。這結(jié)果表明，前列腺癌細(xì)胞株LNCaP及PC-3通過LRP的表達(dá)，即有部分的耐藥能力，通過多西他賽的誘導(dǎo)后，LRP可表達(dá)增加，前列腺癌耐藥可能同時具有繼發(fā)性和原發(fā)性耐藥，導(dǎo)致化療失敗。

曾有報道提示雄激素可加快前列腺癌多藥耐藥的發(fā)生，雄激素受體阻斷劑可部分糾正雄激素的誘導(dǎo)多藥耐藥的作用[11，12]，Ho[13]報道雄激素可增加多藥耐藥蛋白4（MRP4）的表達(dá)，而氟他胺可阻斷雄激素的誘導(dǎo)作用。王素霞等[14]報道在乳腺癌中雌激素受體表達(dá)與肺耐藥相關(guān)蛋白成正相關(guān)。Wartenberg[15]報道外源性丙酮酸可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DU145的P-gp表達(dá)，加快細(xì)胞表柔比星外排，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥。我們發(fā)現(xiàn)耐多西他賽的人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP及PC-3經(jīng)二氫睪酮誘導(dǎo)后，LRP表達(dá)明顯增加，而通過比卡魯胺阻斷雄激素受體后，比卡魯胺可阻斷二氫睪酮的LRP表達(dá)。

綜上所述，耐多西他賽誘導(dǎo)前列腺癌的耐藥相關(guān)蛋白LRP表達(dá)增加，而二氫睪酮可誘導(dǎo)耐多西他賽前列腺癌的耐藥相關(guān)蛋白LRP增量表達(dá)，雄激素受體阻斷劑比卡魯胺可阻斷二氫睪酮的誘導(dǎo)作用，提示在臨床晚期前列腺癌化療時保持去勢狀態(tài)，可減少前列腺癌多藥耐藥的產(chǎn)生。

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