唐 力，蒲德嵐，夏靜芬，汪財生

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波315100）

高效液相色譜法測定淡水貝類中8種鄰苯二甲酸酯

唐 力，蒲德嵐，夏靜芬，汪財生

（浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波315100）

建立了高效液相色譜法同時測定淡水貝類中8種鄰苯二甲酸酯類的方法。樣品以正己烷與二氯甲烷（1∶1）為提取劑，以Agela venusil XBP-C18為分離柱，柱溫25℃，甲醇-水為流動相梯度洗脫，流速1.0mL/min，紫外檢測波長230nm，8種PAEs得到較好分離。在0.5～50μg/mL范圍內(nèi)，線性良好，檢測限在0.2～0.5μg/mL之間，該方法加標(biāo)回收率在91.06%～107.23%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.34%～3.67%之間。方法適用于淡水貝類中鄰苯二甲酸酯的檢測。

鄰苯二甲酸酯，高效液相色譜，貝類

鄰苯二甲酸酯（PAEs），是環(huán)境激素類的一種，作為聚氯乙烯、纖維素樹脂、天然橡膠和合成橡膠的增塑劑廣泛應(yīng)用于塑料工業(yè)中，具有致畸、致突變、致癌以及生殖毒性[1-3]。鄰苯二甲酸酯與塑料分子之間并不是以化學(xué)鍵結(jié)合，而是由氫鍵或范德華力連接，彼此保持各自獨立的化學(xué)性質(zhì)，因此它極易從塑料中釋放，從而轉(zhuǎn)入空氣、水體、底質(zhì)和生物等環(huán)境載體中，通過食物鏈危害著人體健康[4-5]。

鄰苯二甲酸酯類對水體的污染在國內(nèi)已有許多報道，其主要來源于生產(chǎn)和使用鄰苯二甲酸酯類的工廠所排放的工業(yè)污水[6-7]。貝類屬于濾食性生物，移動性相對較差，生活地域極為固定，所處環(huán)境受污染后，難免在濾食餌料時從水中吸入各種有害化學(xué)物質(zhì)，PAEs等有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的親脂性，使其能在貝類中進(jìn)行生物累積，并最終經(jīng)食物鏈傳遞危害人類健康[8-9]。因此，建立一種高效、簡便、準(zhǔn)確的方法來檢測貝類肉中的鄰苯二甲酸酯類，對于開展貝類生物體中PAEs安全評估具有重要的指導(dǎo)意義。

目前，國內(nèi)外PAEs的分析方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，分析的樣品以環(huán)境、食品、塑料樣品為主[10-12]，尚未見對淡水貝類的研究報道。本文選擇了水體中常見的8種PAEs為研究對象，包括美國國家環(huán)保局列入優(yōu)先控制污染物的DMP、DEP、DBP、BBP、DOP、DEHP[13]，以及較受關(guān)注DPP與DIPP，建立了高效液相色譜法同時測定淡水貝類中8種鄰苯二甲酸酯的方法，該方法簡便、快速，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，為淡水貝類中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)準(zhǔn)確的分析提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8種PAEs標(biāo)準(zhǔn)品（DMP、DEP、DPP、DBP、DIPP、BBP、DOP、DEHP） 純度均大于99.5%，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、水 色譜純，美國TEDIA天地試劑公司；正己烷、二氯甲烷 分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；淡水貝類樣品（螺螄、黃蜆和田螺） 寧波市各大超市或菜市場。

Agilent 1100型高效液相色譜 美國安捷倫公司；BS224S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SK8200H型超聲波清洗儀 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；DS200型高速度組織搗碎機(jī) 江蘇江陰周莊紅旗沖件廠；DK-8D型三孔電熱恒溫水槽 上海奇欣科學(xué)儀器有限公司；Neofuge型臺式高速冷凍離心機(jī) 力康發(fā)展有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理 將購置的新鮮貝類置于燒杯中，70℃水浴加熱30min，將貝類除殼以外所有貝肉全部取出，加入適量的生理鹽水后，使用高速組織搗碎機(jī)，以10000r/m in處理5m in，然后移入50m L的離心管中，于4℃，15000r/m in條件下離心15m in。棄去上清液，將下層固體移入小燒杯中待用。

稱取貝肉5g，置于50m L離心管中，加入25m L 1∶1的正己烷和二氯甲烷混合液，500W，53Hz超聲提取30min后，在4℃下以15000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，移取上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，濃縮液移入2m L試管中，用甲醇定容到2m L，保存?zhèn)溆谩y定時，提取液需經(jīng)聚苯乙烯柱凈化和0.45μm有機(jī)濾膜過濾后供HPLC測定，每個樣品平行測定三次。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 以甲醇為溶劑，配制濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、25、50μg/m L的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外標(biāo)法計算樣品中PAEs的含量。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agela venusil XBP-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-水梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測器為紫外檢測器，檢測波長230nm；流速1.0m L/m in；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：1μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradientelution program

2 結(jié)果與討論

2.1 條件優(yōu)化實驗

2.1.1 樣品處理條件選擇 鄰苯二甲酸酯是親脂性有機(jī)化合物，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。本實驗考察了正己烷、二氯甲烷、乙腈以及混合液的提取效果，不同溶劑的提取效果見表2所示，結(jié)果表明單一溶劑提取的PAEs種類偏少，提取效果較差，而采用混合溶劑提取時，效果明顯優(yōu)于單一溶劑，因此實驗選用1∶1的正己烷和二氯甲烷混合液作為提取液。

改變超聲萃取時間，考察鄰苯二甲酸酯類提取效果，選擇超聲時間分別為10、20、30、40m in。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨超聲時間的增加，提取組分的種類和提取量也逐漸增加，并在30m in達(dá)到最大值，超聲時間進(jìn)一步增加，提取的PAEs種類和提取量并無顯著變化，結(jié)果見表3，因此，超聲提取鄰苯二甲酸酯類的時間控制在30min為宜。

表2 不同溶劑對鄰苯二甲酸酯提取效果的影響（mg/kg）Table 2 Effectof different extraction solvents on extraction of phthalic acid esters（mg/kg）

表3 超聲時間對鄰苯二甲酸酯提取效果的影響（mg/kg）Table 3 Effectof ultrasonic time on extraction of phthalic acid esters（mg/kg）

2.1.2 色譜條件的選擇 PAEs在紫外檢測區(qū)230、254、275nm均有不同程度的吸收峰，結(jié)果顯示在波長230nm下鄰苯二甲酸酯類的吸收強(qiáng)度明顯高于其他兩波長，結(jié)果見圖1所示，因此選擇230nm作為檢測波長。

圖1 不同波長下PAEs樣品色譜圖Fig.1 The chromatogram of PAEs standards at differentwavelengths

采用HPLC測定PAEs時，流動相常選用水-甲醇體系，本實驗以水-甲醇（25∶75）為流動相進(jìn)行洗脫時，PAEs各色譜峰都具有一定的分離度，但DSP與DPP、BBP與DBP、DEHP與DOP三組由于結(jié)構(gòu)相似或存在同分異構(gòu)體關(guān)系或相對分子質(zhì)量接近，R＜1.5，因此考慮以水-甲醇作為基礎(chǔ)流動相探索梯度洗脫條件。在如表1所示的條件下，8種PAEs完全分離，出峰時間在21m in以內(nèi)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜分析

本實驗采用保留時間定性，峰面積外標(biāo)法定量分析。標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜分離情況如圖2所示。

圖2 8種PAEs標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 8 PAEs standards

在1.2.3設(shè)定的色譜條件下，將配制好的PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析，以色譜峰面積（y）對相應(yīng)質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比計算8種PAEs的檢測限，結(jié)果見表4。

表4 8種PAEs標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測限Table 4 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，detection limits of 8 PAEs standards

2.3 回收率和精密度

實驗以螺螄肉為樣品，測定PAEs的回收率，取5g螺螄肉，分別加入濃度為5.00、20.00、40.00μg/m L的鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5m L，每個添加量平行測定5次，計算回收率和精密度，結(jié)果見表5。8種PAEs三個水平的回收率在91.06%～107.23%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.34%～3.67%，表明該方法具有較好的回收率與精密度。

表5 8種PAEs的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Recoveries and RSDs of 8 PAEs

2.4 實際樣品分析

采用本文建立的方法，對購買的三種淡水貝類（螺螄、黃蜆和田螺）進(jìn)行測定，樣品均能檢測出一定量的PAEs，檢測結(jié)果見表6，圖3為螺螄實際樣品的色譜圖。

表6 三種貝類中PAEs的檢測結(jié)果（mg/kg）Table 6 The detection results of 8 PAEs in 3 kinds of shellfish（mg/kg）

3 結(jié)論

本文以正己烷和二氯甲烷為提取劑，液液萃取貝類中的8種PAEs，以甲醇-水為流動相采用高效液相色譜法建立了淡水貝類中鄰苯二甲酸脂類化合物的檢測方法。方法操作簡便，回收率高，重現(xiàn)性好。在實際樣品分析中，螺螄、黃蜆和田螺中8種PAEs均有檢出。

圖3 實際樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of real samples

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Determ ination of eight phthalic acid esters in freshwater shellfish by high performance liquid chromatography

TANG Li，PU De-lan，XIA Jing-fen，WANG Cai-sheng
（School of Biological and Environmental Sciences，ZhejiangWanliUniversity，Ningbo 315100，China）

The method for the quantitative analysis of eight phthalic acid esters in freshwater shellfish was estab lished by high performance liquid chromatog raphy.The sam p les were extracted by hexane and dichloromethane（1∶1）and separated by an Agela venusil XBP-C18column w ith the column tem perature of 25℃.The mobile phase was composed ofmethanol and water，and used w ith g rad ient elution at the flow rate of 1.0m L/m in.The UV detec tion wavelength was 230nm.The separation of eight phthalic acid esters was good. The standard curves were linear in the range from 0.5 to 50μg/m L，w ith the lim its of detec tion ranging from 0.2μg/m L to 0.5μg/m L.The additional standard recoveries of the method were in the range from 91.06%～107.23%，and the relative standard deviation from 0.34%to 3.67%.The p roposed method could be app lied to the determ ination of phthalic acid esters in shellfish.

phthalic acid esters；HPLC；shellfish

TS201.6

A

1002-0306（2014）18-0063-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.004

2013－12－31

唐力（1979－），女，碩士研究生，講師，研究方向：色譜及光譜分析與應(yīng)用。

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目（2013C37074）；寧波市自然科學(xué)基金（2012A610151）。