李金永，劉書亮，*，姚 開，李建龍

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065）

絲狀真菌對3-苯氧基苯甲酸降解能力及特性的研究

李金永1，劉書亮1，*，姚 開2，李建龍1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065）

以實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)黃青霉QH、米曲霉MAY、高大毛霉MHC、黑根霉GH、啤酒酵母Y1和假絲酵母Y2等6株真菌為出發(fā)菌株，在PD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h，QH、MAY、MHC和GH對100mg/L 3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的降解率分別為77.12%、77.19%、55.46%和72.38%；而Y1和Y2對3-PBA無降解。在MM培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h，6株真菌均未生長，對3-PBA無降解。14株已知霉菌和從環(huán)境中分離的12株霉菌及4株酵母菌進(jìn)行3-PBA降解實(shí)驗(yàn)，測試的26株霉菌在PD培養(yǎng)基中對3-PBA均有不同程度的降解，4株酵母菌未有降解，推測絲狀真菌可能具有降解3-PBA的共性。由HPLC譜圖可知，不同種類霉菌降解3-PBA的產(chǎn)物不同，可能有不同的3-PBA降解途徑與機(jī)制。此外，3-PBA對本研究所測試的絲狀真菌的生長都有一定的抑制作用。

絲狀真菌，3-苯氧基苯甲酸，降解特性

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種廣泛使用的殺蟲劑，而它的降解中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）則是一種潛在的環(huán)境污染物[1-2]，因?yàn)?-PBA比擬除蟲菊酯類農(nóng)藥更加穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，3-PBA是一種潛在的環(huán)境雌激素類物質(zhì)[3]，對環(huán)境和人類的健康存在著一定的威脅。此外，3-PBA還能導(dǎo)致擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生物礦化作用受阻，切斷該類農(nóng)藥徹底轉(zhuǎn)化為無毒小分子的生物降解途徑[4]，從而間接地使農(nóng)藥殘留問題更加嚴(yán)峻。如何降低或消除環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中3-PBA的污染，受到人們的廣泛關(guān)注。

微生物降解作用是降解有機(jī)污染物的一種重要方式，目前已有較多相關(guān)的研究報(bào)道[5-8]。微生物降解農(nóng)藥一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但微生物作用尤其是真菌降解3-PBA的研究少見報(bào)道。目前，對于微生物降解3-PBA的研究多為降解菌種的篩選及其特性分析，并且研究對象主要以細(xì)菌為主[9-13]。霉菌對環(huán)境的凈化具有重要作用，其對二苯醚鍵結(jié)構(gòu)化合物降解具有一定優(yōu)勢[14]，然而將霉菌用于3-PBA降解的研究卻鮮見報(bào)道。本研究采用實(shí)驗(yàn)室保存的10余種已知絲狀真菌以及從土壤、茶葉、醋醅等環(huán)境中分離的一些真菌對3-PBA進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，探討了其對3-PBA的降解情況，為進(jìn)一步開展絲狀真菌對3-PBA的降解途徑及其開發(fā)利用提供鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）QH、米曲霉（Aspergillus oryzae）MAY、高大毛霉（Mucor mucedo）MHC、黑根霉（Rhizopus nigricans）GH四種常用霉菌，啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y1、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）Y2，黑曲霉（Aspergillus niger）CICC40188、米曲霉CICC2279等菌株 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室收集保存；米曲霉M3、米曲霉M4、土曲霉（Aspergillus terreus）M12、米曲霉M13、黑曲霉YAT、綠色木霉（Trichoderma viride）315、康氏木霉（Trichoderma koningii）316、紫紅曲霉（Monascus purpureus）318、產(chǎn)黃青霉LJ1、點(diǎn)青霉（Penicillium notatum）LJ5、產(chǎn)黃青霉LJ2-1、灰黃青霉（P. griseofulvum）JLG等菌株 由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；土樣 從四川雅安不同茶園采集土樣兩份，每份500g；兩種茯磚茶 產(chǎn)地：湖南，2011和2012，市售，每種200g；醋醅兩份 從四川某釀造企業(yè)采集，每份200g；土豆蔗糖培養(yǎng)基（PD） 新鮮土豆300g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL，吐溫80 2.0g，pH6.0，121℃滅菌15min；土豆蔗糖固體培養(yǎng)基（PDA） 在PD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂；基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（MM） （NH4）2SO41.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.5g，Tween 80 2.0g，蒸餾水1000mL，pH7.0，121℃滅菌15min；3-苯氧基苯甲酸 純度98%，美國Sigma公司；檢測用乙腈 色譜純，德國CNW Technologies GmbH公司；乙腈 分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

LC-10A2010C HT型液相色譜儀 日本Shimazu公司；AS10200A型超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離 將收集的土壤、茶葉和醋醅樣品粉碎，稱量10g，分別轉(zhuǎn)移到含0.1%吐溫80和0.1%瓊脂的90mL無菌生理鹽水中，充分搖勻后靜置。采用稀釋分離法，將樣液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取100μL稀釋液涂布于添加50μg/mL氯霉素的PDA平板上，30℃倒置培養(yǎng)，待長出單個菌落后挑選分離，30℃倒置培養(yǎng)。經(jīng)多次分離并鏡檢觀察至純化后，采用PDA試管斜面培養(yǎng)后于4℃保存，備用。

1.2.2 孢子（菌）懸液的制備 將產(chǎn)黃青霉QH、米曲霉MAY、高大毛霉MHC、黑根霉HG 4株霉菌和啤酒酵母Y1、假絲酵母Y2 2株酵母菌分別接種于PDA平板上30℃培養(yǎng)72h，分別轉(zhuǎn)接于PDA試管斜面，30℃培養(yǎng)72h后在無菌條件下分別用無菌生理鹽水（含0.1%瓊脂和0.1%吐溫80）制成孢子（菌）懸液，采用平板稀釋計(jì)數(shù)法調(diào)節(jié)孢子（菌）濃度為5.0×108個/mL。

1.2.3 接種培養(yǎng) 將4株霉菌和2株酵母菌的孢子（菌）懸液各1mL分別接種于30mL含100mg/L 3-PBA的PD（PD-3-PBA）和MM（MM-3-PBA）培養(yǎng)基中，并用無菌生理鹽水1mL代替孢子（菌）懸液作空白對照。于30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h，測定各培養(yǎng)液中3-PBA的殘留量。

1.2.4 培養(yǎng)液中3-PBA的提取與測定 培養(yǎng)后取整瓶培養(yǎng)液，加入等體積乙腈，40kHz、300W超聲30min，輔助提取培養(yǎng)液中3-PBA。取2.0mL超聲提取液用乙腈定容至10mL，混勻，取1.5mL混勻后的提取液于2mL EP管中，12000r/min離心10min，上清液用0.45μm有機(jī)相濾膜過濾，棄去初濾液，HPLC檢測續(xù)濾液中3-PBA殘留質(zhì)量濃度[15]。色譜條件：色譜柱為Gemini 100? C18柱（5.0μm，150mm×4.60mm（i.d.））；流動相為乙腈-磷酸水（pH2.5）（55∶45，v/v），流速為0.7mL/min；紫外檢測器波長為210nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10μL[16-17]。3-PBA的濃度與HPLC測定的相應(yīng)峰面積呈正比，用HPLC測定的相應(yīng)峰面積表示3-PBA的濃度。

3-PBA降解率按下式計(jì)算：

式中：C0為空白對照中3-PBA總質(zhì)量濃度（mg/L）；C為樣品培養(yǎng)液中3-PBA殘留質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)室保存菌株和分離菌株對3-PBA的降解實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)室保存的已知14株霉菌和分離的菌株按1.2.4方法測定各菌株對100mg/L 3-PBA的降解率，根據(jù)菌種特性確定不同培養(yǎng)時間。

1.2.6 代表性菌株對3-PBA的降解曲線及生長曲線測定 根據(jù)種屬不同以及降解產(chǎn)物的差異從中選擇幾株菌作為代表性菌株，并測定其對3-PBA的降解曲線及生長曲線。將選擇的代表性菌株種子液各1mL分別接種于PD和PD-3-PBA（3-PBA質(zhì)量濃度為100mg/L）培養(yǎng)基中。并同時設(shè)置空白對照組（接種等量的無菌生理鹽水）。30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)，采用全量取樣的方式進(jìn)行間隔取樣，分別測定3-PBA殘留質(zhì)量濃度及菌體生物量，菌體生物量（g/L）以干重計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4株霉菌及2株酵母菌對3-PBA的降解情況

經(jīng)過HPLC檢測，四株霉菌（產(chǎn)黃青霉QH、米曲霉MAY、高大毛霉MHC、黑根霉GH）在添加100mg/L 3-PBA的PD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48h后，對3-PBA的降解率分別為77.12%、77.19%、55.46%、72.38%；在MM-3-PBA培養(yǎng)基中菌株均不生長、對3-PBA無降解。微生物對異生化合物的降解主要以礦化作用和共代謝方式為主。礦化作用即微生物利用目標(biāo)異生化合物作為其生長的唯一碳源和能源，使之徹底降解為無毒小分子（二氧化碳和水等）[18]；而共代謝作用是一種不徹底的降解作用，是指微生物必須借助其他物質(zhì)為其提供生長所需的碳源或能源和降解異生化合物所需的能量[19]。供試霉菌不能利用3-PBA作為唯一碳源，而是在其他碳源或能源存在的情況下降解3-PBA，說明供試霉菌以共代謝的方式降解3-PBA。而啤酒酵母Y1和假絲酵母Y2在PD和MM培養(yǎng)基中對3-PBA均無降解，且在MM培養(yǎng)基中不生長。

通過HPLC譜圖（圖1）可以看出四株霉菌降解3-PBA產(chǎn)生的新物質(zhì)存在差異。圖1中吸收峰保留時間為7.18min處的A物質(zhì)為3-PBA，MHC降解3-PBA可能產(chǎn)生了新物質(zhì)C（吸收峰保留時間為3.71min），GH降解3-PBA可能產(chǎn)生了新物質(zhì)B（吸收峰保留時間為6.65min），QH降解3-PBA可能產(chǎn)生了物質(zhì)C和物質(zhì)D（吸收峰保留時間為3.11min），MAY降解3-PBA可能產(chǎn)生了物質(zhì)B和物質(zhì)C，說明不同的霉菌降解3-PBA的機(jī)制和途徑不同。

圖1 四種霉菌降解3-PBA產(chǎn)物的HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 3-PBA degraded by four kinds of molds

2.2 供試菌株對3-PBA的降解情況

2.2.1 菌株分離結(jié)果 根據(jù)菌落特征及顯微鏡觀察，從土壤、茶葉和醋醅樣品中共分離、篩選到16株真菌。初步鑒定有12株為霉菌，其中4株為冠突散囊菌，編號為E1、E2、E3、E4；4株曲霉，編號為A1、A2、A3、A4；3株毛霉，編號為R1、R2、R3和1株木霉T1。并分離到4株酵母菌，編號為S1、S2、S3、S4。

2.2.2 供試菌株對3-PBA降解情況 由表1可知，供試30株菌中，26株霉菌對3-PBA均有不同程度的降解，其中康氏木霉316降解率最低為22.23%，其余霉菌降解率均超過50%，部分菌株幾乎可將100mg/L的3-PBA完全降解；而分離的4株酵母菌對3-PBA均不降解。通過2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果和表1可以推斷絲狀真菌—霉菌對3-PBA均有不同程度的降解作用。

2.3 代表性霉菌對3-PBA的降解曲線及生長曲線

由圖2可知，培養(yǎng)72h后產(chǎn)黃青霉LJ1在兩種培養(yǎng)基中的細(xì)胞干重有明顯差異。LJ1在PD培養(yǎng)基中，經(jīng)過5h的延滯期后開始生長，50h后生長趨于平緩，最終細(xì)胞干重為5.52g/L。LJ1在PD-3-PBA中培養(yǎng)時，15h后開始緩慢生長，30h后進(jìn)入快速生長期，50h后生長趨于平緩，最終細(xì)胞干重為4.32g/L。通過LJ1在PD和PD-3-PBA中的生長曲線可以看出，3-PBA對LJ1的生長有一定的抑制作用，使其延滯期增長，并且影響了LJ1的最終生物量。

圖2 產(chǎn)黃青霉LJ1降解3-PBA曲線Fig.2 Degradation curve of 3-PBA by P.chrysogenum LJ1

由圖2的3-PBA降解曲線可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，LJ1不能將100mg/L的3-PBA完全降解，培養(yǎng)72h時，3-PBA降解率為89.35%。結(jié)合生長曲線，培養(yǎng)5h后3-PBA開始出現(xiàn)降解，培養(yǎng)30～40h降解緩慢，40h后幾乎不再降解。而LJ1在25h內(nèi)生長緩慢，30h后生長加快，對3-PBA的降解有一定的關(guān)聯(lián)，即3-PBA能夠抑制LJ1的生長，隨著3-PBA的降解，抑制作用逐漸降低，3-PBA的濃度與抑制LJ1生長作用呈正相關(guān)。同時通過圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，物質(zhì)A（3-PBA）殘留量逐漸減少，而物質(zhì)C卻相應(yīng)的增加，推測其是3-PBA的代謝產(chǎn)物之一。

米曲霉M13在PD-3-PBA中的生長曲線及對3-PBA的降解曲線如圖4所示，由圖4可知，3-PBA對米曲霉M13的生長同樣存在一定的抑制作用。在PD培養(yǎng)基中，M13在10h后開始緩慢增長，20h后進(jìn)入快速生長期，40h后生長趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)48h后細(xì)胞干重達(dá)到6.43g/L。而在PD-3-PBA培養(yǎng)基中，M13在18h后才開始緩慢生長，48h后細(xì)胞干重達(dá)5.81g/L。

表1 供試菌株對3-PBA的降解情況Table.1 Degradation of 3-PBA by tested strains

圖3 不同時間產(chǎn)黃青霉LJ1的PD-3-PBA體系樣品的HPLC譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of samples taken from PD-3-PBA culture systems for P.chrysogenum LJ1 at different incubation

圖4 米曲霉M13降解3-PBA曲線Fig.4 Degradation curve of 3-PBA by A.oryzae M13

由圖4中的3-PBA降解曲線可知，M13在48h內(nèi)能將100mg/L的3-PBA完全降解。同時從HPLC譜圖（圖5）中可以看出，隨著3-PBA的降解，有兩種新物質(zhì)出現(xiàn)，即物質(zhì)B和物質(zhì)C，3-PBA與物質(zhì)B和C之間有一定的消長關(guān)系，推測是3-PBA的代謝中間產(chǎn)物。

圖5 不同時間米曲霉M13的PD-3-PBA體系樣品的HPLC譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of samples taken from PD-3-PBA culture systems for A.oryzae M13 at different incubation

毛霉R3在PD-3-PBA中的生長曲線及對3-PBA的降解曲線如圖6所示，毛霉R3的生長同樣受到3-PBA的抑制，表現(xiàn)在延滯期的增長以及最終的細(xì)胞干重減少。在本實(shí)驗(yàn)條件下，R3對3-PBA的降解率為58.02%。

圖6 毛霉R3降解3-PBA曲線Fig.6 Degradation curve of 3-PBA by Mucor R3

從其HPLC譜圖中（圖7）可以看出，菌株R3降解3-PBA產(chǎn)生的物質(zhì)與米曲霉M13的相同，都有物質(zhì)B和物質(zhì)C產(chǎn)生。

圖7 不同時間毛霉R3的PD-3-PBA體系樣品的HPLC譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of samples taken from PD-3-PBA culture systems for Mucor sp.R3 at different incubation

冠突散囊菌E1在PD-3-PBA中的生長曲線及對3-PBA的降解曲線如圖8所示，冠突散囊菌E1的生長與青霉LJ1、毛霉R3、曲霉M13相比要緩慢的多。E1培養(yǎng)8d后生長才趨于穩(wěn)定，并且最終細(xì)胞干重量也要比其他三種霉菌少，相同的是3-PBA對E1的生長同樣存在抑制。

圖8 冠突散囊菌E1降解3-PBA曲線Fig.8 Degradation curve of 3-PBA by Eurotium cristatum E1

而E1降解3-PBA的產(chǎn)物與其他三種存在一定的差異，如圖9所示，同樣有新物質(zhì)C產(chǎn)生，但在保留時間2.2min處出現(xiàn)了新的吸收峰，即物質(zhì)E。

圖9 不同時間冠突散囊菌E1的PD-3-PBA體系樣品的HPLC譜圖Fig.9 HPLC chromatograms of samples taken from PD-3-PBA culture systems for Eurotium cristatum E1 at different incubation

通過測試的四種霉菌在PD以及PD-3-PBA中的生長曲線以及對3-PBA的降解情況可以看出，3-PBA對測試的四種霉菌的生長均存在一定的抑制作用，隨著3-PBA的降解，抑制作用逐漸減弱，但最終的生長量會有所下降?？梢酝茢?-PBA對霉菌的生長都存在一定的抑制作用，表現(xiàn)為延滯期增長、最終生物量降低，但這種抑制并沒有影響菌株對3-PBA的降解。隨著菌株的生長，3-PBA殘留量不斷減少，抑制作用也逐漸降低，菌體生長速度加快和生物量得到積累，其原因可能與菌株不斷調(diào)整酶與輔酶的合成以適應(yīng)環(huán)境的改變有關(guān)，這與3-PBA對真菌具有較強(qiáng)毒性作用的報(bào)道相符合[12]。并且通過其降解3-PBA的HPLC譜圖可以看出，雖然測試的四種霉菌對3-PBA都有降解，但降解產(chǎn)物卻并不相同，可以判斷它們降解3-PBA的途徑和機(jī)制存在一定的差異。根據(jù)已有的相關(guān)報(bào)道[8，20-21]，推測其降解途徑可能是將3-PBA的二苯醚鍵斷裂，產(chǎn)生單苯環(huán)物質(zhì)或進(jìn)一步降解；或經(jīng)過中間轉(zhuǎn)化再將二苯醚鍵斷裂，其降解途徑和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過真菌對3-PBA降解的初步研究，得出實(shí)驗(yàn)室保存的和從環(huán)境中分離的共30株不同霉菌對3-PBA均有不同程度的降解，而供試的6株酵母菌對3-PBA均無降解能力。推測絲狀真菌—霉菌可能具有降解3-PBA的共性。并且通過HPLC譜圖可以看出，不同種類的霉菌降解3-PBA的產(chǎn)物不同，說明其降解3-PBA的途徑與機(jī)制不同，其產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物能否被進(jìn)一步降解以及其不同的途徑和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3-PBA對真菌的生長具有抑制作用，但這種抑制作用并沒有影響其對3-PBA的降解。

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Study on characteristics and ability of degradation effect of 3-phenoxybenzoic acid by filamentous fungi

LI Jin-yong1，LIU Shu-liang1，*，YAO Kai2，LI Jian-long1
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.College of Light Industry and Food，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

Six strains saved in laboratory including Penicillium chrysogenum QH，Aspergillus oryzae MAY，Mucor mucedo MHC，Rhizopus nigricans GH，Saccharomyces cerevisiae Y1 and Candida utilis Y2 were clutured in PD medium of 48h with oscillation.3-phenoxybenzoic acid（100mg/L）were degraded by four mold stains 77.12%，77.19%，55.46%，72.38%respectively.However，stains Y1 and Y2 had no degradation to 3-PBA.The six strains had no growth and no degradation to 3-PBA after oscillating clutured 48h in MM medium.Twelve strains of mold and 4 strains of yeasts isolated from environment，14 strains of known mold were tested for 3-PBA degradation，26 strains of mold had different degrees of degradation to 3-PBA and 4 strains of yeasts have no degradation in PD medium.We could speculate that filamentous fungi had the ability to degrade 3-PBA in common.Result indicated that different mold might have different 3-PBA degradation pathways and result in different degradation products showed in HPLC chromatograms.In addition，3-PBA had inhibitory effect on the growth of filamentous fungi tested in the study.

filamentous fungi；3-phenoxybenzoic acid；degradation characteristics

Q939.5

A

1002-0306（2014）06-0161-06

2013－07－19 *通訊聯(lián)系人

李金永（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31371775）。