陳 真趙瀛蘭晏菊芳

（1.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川海思科制藥有限公司，四川 成都 611130）

LC-MS/MS法測(cè)定比格犬血漿中的阿那曲唑

陳 真1，2，趙瀛蘭1，晏菊芳2

（1.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.四川海思科制藥有限公司，四川 成都 611130）

用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測(cè)定比格犬血漿中阿那曲唑的濃度。以苯磺酸氨氯地平為內(nèi)標(biāo)，加入50μL血漿，用甲基叔丁基醚萃取后取上清液以氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇水溶液復(fù)溶，進(jìn)樣5μL，在電噴霧離子源下進(jìn)行正離子檢測(cè)。色譜柱為Agilent XDB C18（50mm×2.1mm×3.5μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（60∶40）。阿那曲唑和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)荷比（m/z）分別為294.4和409，阿那曲唑和內(nèi)標(biāo)生成的主要碎片離子的質(zhì)荷比（m/z）分別為255.3和238。阿那曲唑在0.5～500ng·mL-1內(nèi)線性良好，檢出限為0.5ng·mL-1，提取回收率均大于80%，日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度為101%～104%，日內(nèi)、日間精密度分別小于7.04%和8.69%，已成功檢測(cè)比格犬血漿中阿那曲唑的血藥濃度。所用方法穩(wěn)定、靈敏度好、分析時(shí)間短、提取回收率高，適用于比格犬血漿中阿那曲唑的血藥濃度測(cè)定。

阿那曲唑；液質(zhì)聯(lián)用；血藥濃度；液液萃取

0 引言

阿那曲唑是一種強(qiáng)效、高選擇性的非甾體類芳香化酶抑制劑，臨床上廣泛應(yīng)用于絕經(jīng)后婦女晚期乳腺癌的治療。絕經(jīng)后婦女雌激素主要由外周組織中腎上腺雄激素經(jīng)芳香酶作用轉(zhuǎn)化而來，芳香酶是一種CYP45O復(fù)合酶，可氧化脫去C19類固醇（雄烯二酮和睪酮）的19-甲基，使A環(huán)芳香化，從而轉(zhuǎn)變成C19雌激素（雌酮和雌二醇）。絕大多數(shù)乳腺癌病人體內(nèi)雌激素受體呈陽性，腫瘤在雌激素刺激下生

長(zhǎng)。阿那曲唑具有高度選擇性，能有效抑制此酶的活性，充分阻斷絕經(jīng)后婦女內(nèi)源性雌激素的合成，降低體循環(huán)內(nèi)雌激素水平，有效阻滯腫瘤生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[1]。由于該藥口服劑量小，血漿中藥物濃度很低且干擾物質(zhì)多，所以對(duì)其血藥濃度分析方法的檢測(cè)靈敏度和選擇性要求較高。文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)阿那曲唑的血藥濃度檢測(cè)方法有HPLC-RIA法[2]、氣相色譜-電子捕獲法[3]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[4-5]，皆為以人血漿或組織為基質(zhì)建立的分析方法，且基質(zhì)用量大，不適用于比格犬藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)血漿樣品的高通量分析。本研究建立了快速、靈敏、特異的LC-MS/MS法，用于測(cè)定比格犬血漿中的阿那曲唑，達(dá)到“化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則”中對(duì)于生物樣品分析方法的要求，為研究該藥在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)提供可靠的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津）；API3200三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX）；5804R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德）；XS105分析天平（梅特勒托利多）；D11931純水儀（美國(guó)熱電）；MTN-2800W氮吹儀（天津奧特賽恩斯）。瑞寧德阿那曲唑片（阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)：WB0130，每片含1mg阿那曲唑）；阿那曲唑?qū)φ掌罚ㄉ虾Ｓ詈噌t(yī)藥科技，批號(hào)：F0H034，純度99.9%，USP）；內(nèi)標(biāo)苯磺酸氨氯地平（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100825-200501）；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；水為超純水；甲基叔丁基醚為分析純；空白比格犬血漿為肝素鈉抗凝。雄性比格犬（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：SCXK（Chuan）2006-024）6只，體重5～8kg。

1.2 方法與結(jié)果

（1）溶液的配制。精密稱取10mg阿那曲唑，加入10mL甲醇，配成1mg·mL-1的貯備液。臨用時(shí)以甲醇將貯備液稀釋至以下濃度：5，10，50，100，200，500，1000，2000，5000ng·mL-1，即為所需標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取10mg苯磺酸氨氯地平，加入10mL甲醇，配成1mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)貯備液，精密吸取300μL 1mg·mL-1內(nèi)標(biāo)貯備液，以甲醇定容至10mL，配成30μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)中間溶液，再吸取1mL 30μg·mL-1中間溶液，加入9mL甲醇，即為3μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)溶液均置4℃下保存。

（2）色譜條件。采用Agilent Zorbax，XDB C18色譜柱（50mm×2.1mm×3.5μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（60∶40，v/v），流速0.4 mL·min-1，柱溫35℃，進(jìn)樣量5 μL。采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行正離子檢測(cè)，阿那曲唑m/z294.4→225.3，去簇電壓（DP）45V，射入電壓（EP）5V，碰撞能量（CE）29 V，碰撞室出口電壓（CXP）5 V；內(nèi)標(biāo)m/z409→238，去簇電壓（DP）30V，射入電壓（EP）3.1V，碰撞能量（CE）23V，碰撞室出口電壓（CXP）4V，阿那曲唑的出峰時(shí)間約1.1 min，內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間約0.8min，色譜運(yùn)行時(shí)間3min。

（3）血漿樣品前處理。吸取50 μL空白血漿或樣本至1.5mL離心管中，加入5μL“（1）”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液（標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品）或甲醇（待測(cè)血樣），加入5 μL 3 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻，再加入500μL甲基叔丁基醚，漩渦混勻2min，于4℃、2250g·min-1離心10 min，吸取上清液400 μL，氮?dú)獯蹈?，殘留物?00μL 50%甲醇復(fù)溶，于4℃、2250g·min-1離心10min后，取5μL上清液進(jìn)樣。

（4）方法專屬性。分別取6只比格犬的空白血漿，不加內(nèi)標(biāo)溶液（以等體積甲醇補(bǔ)足），其余按“（3）”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)；取對(duì)照品溶液按“（3）”項(xiàng)方法處理，阿那曲唑和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為1.1min、0.8min；取給藥后2h收集的血漿樣品同法操作。結(jié)果表明，樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿那曲唑和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。色譜圖見圖1。

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限。取50μL空白血漿，加5 μL“（1）”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別配成相當(dāng)于含阿那曲唑0.5，1，5，10，20，50，100，200，500ng·mL-1的血漿樣品。按“（3）”項(xiàng)方法處理，進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖。以阿那曲唑的濃度為橫坐標(biāo)、阿那曲唑與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用加權(quán)（W=1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到回歸方程：Y=0.040 8X+0.0041（r=0.998 1）。阿那曲唑的線性范圍為0.5～500 ng·mL-1，檢出限為0.5ng·mL-1。

（6）基質(zhì)效應(yīng)。取50μL空白血漿，按“（3）”項(xiàng)操作制備18份提取后的空白樣品，取400 μL上清液，分別加入低、中、高濃度質(zhì)控溶液（15，400，4 000 ng·mL-1）和內(nèi)標(biāo)溶液各5 μL，氮?dú)獯蹈珊?，?0%甲醇復(fù)溶至100μL，進(jìn)樣并記錄色譜峰面積。與相應(yīng)同濃度的6份標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果比較，以二者的峰面積比值計(jì)算其基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高濃度及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)分別為89.2%±3.18%、92.3%±5.79%、90.8%±3.93%、91.6%± 4.17%，比值均在85%～115%，RSD＜15%，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小。

圖1 空白血漿（A）、空白血漿+對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)（B）、血樣（C）溶液中阿那曲唑（1）及內(nèi)標(biāo)（2）的專屬性色譜圖

（7）提取回收率。取50μL空白血漿，分別加入低、中、高濃度質(zhì)控溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各5 μL，得到1.5，40，400ng·mL-1的質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度質(zhì)控樣本制備6份，按“（3）”項(xiàng)處理，進(jìn)樣并記錄色譜峰面積。與“（6）”項(xiàng)相應(yīng)同濃度的6份空白血漿提取后加入質(zhì)控溶液的樣本相比較，以二者的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果低、中、高濃度及內(nèi)標(biāo)的提取回收率分別為83.0%±2.38%、81.9%±4.96%、83.7%±4.23%、85.4%±4.52%，RSD＜15%。將18份低、中、高濃度質(zhì)控樣品的阿那曲唑/內(nèi)標(biāo)峰面積比代入當(dāng)日的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得低、中、高濃度的方法回收率分別為104%±6.78%、101%±7.14%、102%±2.25%。

（8）精密度和準(zhǔn)確度。取50μL空白血漿，按“（3）”項(xiàng)方法配制低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度質(zhì)控樣本各6份，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度，見表1。

（9）穩(wěn)定性試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液在2～8℃避光條件下穩(wěn)定，至少可儲(chǔ)存35d。阿那曲唑低、中、高濃度樣品在室溫下放置6.5 h，提取后在4℃放置4 d，反復(fù)凍融3個(gè)循環(huán)，在-80℃保存34d的穩(wěn)定性皆較好，變化均＜15%，該化合物及分析方法的穩(wěn)定性較好，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表1 LC-MS/MS測(cè)定比格犬血漿中阿那曲唑的準(zhǔn)確度和精密度

（10）藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。6只雄性成年比格犬，禁食過夜，經(jīng)口給藥，給藥劑量為1mg/只，于給藥前（0h）和給藥后1，2，4，8，12，24h由前肢頭靜脈取血，每次取血2mL，置肝素鈉真空采血管中，離心后分離血漿，于-80℃保存。待測(cè)血漿樣品按“（3）”項(xiàng)方法進(jìn)行前處理，以當(dāng)天工作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)分析低、中、高濃度的質(zhì)控樣品（各濃度不少于兩個(gè)），記錄樣本的阿那曲唑/內(nèi)標(biāo)峰面積比，根據(jù)回歸方程計(jì)算每個(gè)血漿樣本的藥物濃度。比格犬體內(nèi)阿那曲唑的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。以DAS（V 2.0）軟件分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，得到 Cmax為37.27±8.21μg·L-1、AUC0-t為454.19±55.21 μg·h·L-1、 MRT0-t為 8.42±0.58為 8.58±1.95 h、Tmax為 1.17±0.41 h、CLz/F為1.91±0.32 L·h-1、Vz/F為23.15± 3.30L。

Determination of anastrozole in beagle dog plasma by LC-MS/MS

CHEN Zhen1，2，ZHAO Ying-lan1，YAN Ju-fang2
（1.State Key Laboratory of Biotherapy，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.Sichuan Haisco Pharmaceutical CO.，Ltd，Chengdu 611130，China）

The HPLC-tandem mass spectrometry method（LC-MS/MS）was developed for the determination of anastrozole concentration in beagle dog plasma.50μL plasma samples were mixed with MTBE followed by extraction，the supernatant was dried under N2and re-dissolved by 50% methanol，and 5 μL of which was injected onto LC-MS/MS.The analysis was carried out under the positive mode of electronic-spray ionization（ESI）.Chromatographic column was Agilent XDB C18（50mm×2.1mm×3.5μm），mobile phase was 0.1%formic acid in water-0.1%formic acid in acetonitrile（60∶40）.The mass-to-charge ratio（m/z）of anastrozole and internal standard were 294.4-225.3 and 409-238， respectively.The linear range ofanastrozole was within the concentration of 0.5-500 ng·mL-1.The LOD was 0.5 ng·mL-1.The extraction recoveries were all higher than 80%.The intra-and inter-day accuracy were 101%-104%，the intra-and inter-day precisions（RSD）were less than 7.04%and 8.69%，respectively.The anastrozole concentration in beagle dog plasma was detected successfully.The method was stable，sensitive，speedy and highly recovered.It was suitable for determining the anastrozole concentration in beagle dog plasma.

anastrozole；LC-MS/MS；plasma concentration；LLE

R917；S829.2；R331.1；O657.7+2

：A

：1674-5124（2014）01-0059-03

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.01.016

2013-02-16；

：2013-04-07

陳 真（1981-），女，四川成都市人，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)橹扑幑こ獭?/p>