楊 鑫， 謝 文， 王少麗， 吳青君， 徐寶云， 周小毛， 張友軍＊

（1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，長沙 410128；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

煙粉虱（Bemisia tabaci Gennadius）屬半翅目， 粉虱科，小粉虱屬，是危害極為廣泛的世界性害蟲之一。煙粉虱屬于刺吸式昆蟲，取食寄主植物的汁液，通過直接刺吸為害、傳播植物病毒、引起植物生理紊亂、分泌蜜露誘發(fā)真菌病害給作物生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1－2］。煙粉虱于1889年首先發(fā)現(xiàn)于希臘煙草上，分布于世界100多個(gè)國家，由于地理差異和寄主廣泛等原因逐漸形成多個(gè)復(fù)合種，目前報(bào)道的至少有32個(gè)隱種，不同隱種的煙粉虱在寄主范圍、傳毒能力、共生菌組成以及抗藥性等方面都存在顯著差異，在所有隱種中，B隱種和Q隱種煙粉虱入侵性最強(qiáng)，世界范圍內(nèi)分布最為廣泛［3］。煙粉虱在我國最早報(bào)道于1949年［4］，暴發(fā)于20世紀(jì)90年代，當(dāng)時(shí)B隱種煙粉虱主要存在于廣東、山東、河北、天津和北京等地，給農(nóng)業(yè)、園藝及觀賞作物產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［5－6］。2003年之前在我國發(fā)生為害的主要是B隱種煙粉虱，隨后在河北、北京等地田間發(fā)現(xiàn)Q隱種煙粉虱，并且在2007年發(fā)現(xiàn)Q隱種煙粉虱逐漸取代B隱種煙粉虱成為主要為害種群［7－9］。

在害蟲的防治措施中，化學(xué)防治占居重要地位，為延緩和阻止眾多嚴(yán)重為害經(jīng)濟(jì)作物的害蟲暴發(fā)做出了重要貢獻(xiàn)。但是由于常年、廣泛使用殺蟲劑，導(dǎo)致很多地區(qū)害蟲對一些種類的殺蟲劑產(chǎn)生不同程度的抗藥性，并且在全國監(jiān)測發(fā)現(xiàn)Q隱種煙粉虱對于一些殺蟲劑的抗性要高于B隱種煙粉虱，連年施用后抗藥性也逐漸增強(qiáng)［10－12］，所以連續(xù)的、適時(shí)的抗藥性監(jiān)測是煙粉虱綜合防治的前提和基礎(chǔ)。

煙粉虱的抗藥性產(chǎn)生機(jī)制是多方面的?，F(xiàn)在關(guān)于煙粉虱的抗藥性研究主要集中在解毒酶上，Karunker和Roditakis研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素解毒酶P450家族的基因在B隱種和Q隱種煙粉虱的吡蟲啉抗性中發(fā)揮重要的作用［13－15］。Xie［16］等通過 B隱種煙粉虱噻蟲嗪抗性和敏感品系的轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)CYP4v2基因在抗性品系中過量表達(dá)，同時(shí)Zhuang［17］等發(fā)現(xiàn)CYP6CX1的過量表達(dá)在煙粉虱對吡蟲啉抗性中也產(chǎn)生一定貢獻(xiàn)。

本研究對北京、山東和湖南三地的煙粉虱B、Q隱種類型進(jìn)行了鑒定，同時(shí)測定了其對5種常用殺蟲劑的抗藥性，并且通過熒光定量PCR檢測了CYP4v2和CYP6CX1基因在3個(gè)不同地區(qū)田間種群的mRNA水平表達(dá)情況，從而為解釋田間抗藥性形成機(jī)制和指導(dǎo)當(dāng)?shù)責(zé)煼凼幕瘜W(xué)防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 煙粉虱試蟲

2011年秋季，分別從北京海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所實(shí)驗(yàn)基地（BJHD，39°57′N，116°19′E），山東濟(jì)陽茄子田（SDJY，39°49′N，117°04′E）和湖南長沙農(nóng)科院黃瓜大棚（CSHN，28°12′N，113°05′E）采集煙粉虱成蟲。敏感種群為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所室內(nèi)飼養(yǎng)種群（T H－S），該種群于2000年采自試驗(yàn)基地的甘藍(lán)寄主上，實(shí)驗(yàn)室以甘藍(lán)飼養(yǎng)至今，從未接觸過任何殺蟲藥劑。田間采集的煙粉虱分別取300頭活體成蟲（分裝于3個(gè)離心管，每管100頭），液氮速凍5 min，然后保存于－80℃冰箱用于熒光定量PCR檢測。

1．2 供試殺蟲劑

25%噻蟲嗪水分散粒劑（瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司產(chǎn)品）、1．8%阿維菌素乳油（北京中農(nóng)大生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品）、10%聯(lián)苯菊酯乳油（蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司產(chǎn)品）和48%毒死蜱乳油（美國陶氏益農(nóng)公司產(chǎn)品）。

1．3 主要試劑

昆蟲基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Taq酶，c DNA合成試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit）購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司（Ta KaRa Biotech）；TRIzol，熒光定量試劑盒（SYBR?Green Real－ti me PCR Master Mix）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1．4 B、Q隱種鑒定

煙粉虱成蟲B、Q隱種鑒定參照潘慧鵬［9］的方法進(jìn)行。檢測每個(gè)種群選取10頭，單頭提取DNA，依據(jù)B和Q隱種煙粉虱mt COI基因序列片段長度差異使用特異性引物進(jìn)行鑒別（見表2），其中Q隱種煙粉虱的特異性片段為478 bp，而B隱種煙粉虱為303 bp。

1．5 抗藥性監(jiān)測

煙粉虱成蟲對殺蟲劑的生物測定方法采用浸葉法，具體操作參照Feng［18］。每種供試藥劑配制6個(gè)濃度及1組空白對照，每個(gè)濃度4次重復(fù)，藥劑配制加入0．1‰曲拉通X－100。在指形管底部鋪上2%的瓊脂約2 mL（管壁無水汽），將預(yù)先用打孔器打好的甘藍(lán)葉片浸藥10 s，晾干后背面朝上輕放于瓊脂上。每管接入20～30頭煙粉虱，用棉塞封口。指形管倒置于（25±1）℃，L∥D＝14 h∥10 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后檢查各處理的死亡數(shù)和存活數(shù)。

1．6 RNA提取和c DNA合成

每個(gè)樣品取煙粉虱100頭，采用TRIzol法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，以及Nanodr op2000檢測RNA濃度。取1．0μg RNA利用Pri meScript?RT reagent Kit合成c DNA ，方法按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行 （除去了基因組DNA）。

1．7 熒光定量PCR

熒光定量PCR引物參照Zhuang［17］進(jìn)行（見表1），具體操作參照天根的熒光定量試劑盒說明書，稀釋2倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用ABI7500進(jìn)行基因mRNA水平表達(dá)量分析。熒光定量PCR反應(yīng)體 系：SYBR Green Real－ti me PCR Master Mix（2×）11．25μL，PCR For war d Pri mer（10μmol／L）0．5μL，PCR Reverse Pri mer（10μmol／L）0．5μL，c DNA模板1．0μL，加入dd H2O 補(bǔ)足到25μL。Real－Ti me PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，接下來是40個(gè)循環(huán)，95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸40 s（收集熒光信號）；每個(gè)樣品3次重復(fù)，PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

表1 本研究中應(yīng)用的引物1）Table 1 Pri mers used in this study

1．8 數(shù)據(jù)處理

生測結(jié)果分析采用Probit軟件進(jìn)行，計(jì)算各種群對不同殺蟲劑的LC50值及其95%的置信區(qū)間、斜率及標(biāo)準(zhǔn)誤。抗性倍數(shù)＝所測種群的LC50／敏感種群的LC50。抗性分級標(biāo)準(zhǔn)參照劉鳳沂等［19］，抗性倍數(shù)小于3倍為敏感水平，3．1～5．0倍屬于敏感性降低，5．1～10倍為低水平抗性，10．1～40倍為中等水平抗性，40．1～160倍為高水平抗性，160倍以上為極高水平抗性。

目的基因表達(dá)量以內(nèi)參基因（Actin）作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對定量，Actin基因在不同發(fā)育階段和齡期的煙粉虱體內(nèi)mRNA水平表達(dá)量穩(wěn)定，可以作為內(nèi)參基因?；虮磉_(dá)量分析以敏感種群T H－S作為對照種群，采用2－△△Ct方法計(jì)算：相對表達(dá)量＝2－△△Ct＝2－（［E－F］－［A－B］）。 其 中 A 為 對 照 種 群基因的Ct值；B為對照種群內(nèi)參基因Ct值；E為待測田間種群基因的Ct值，F(xiàn)為待測田間種群內(nèi)參基因Ct值，Ct值取3次重復(fù)相差不超過0．5Ct值的平均值。

2 結(jié)果與分析

2．1 隱種鑒定

從北京、山東和湖南煙粉虱樣品中隨機(jī)選取10頭，提取基因組DNA后分別用B和Q鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的片段長度約為478 bp，說明北京、山東和湖南地區(qū)供試煙粉虱均為Q隱種（見圖1）。

2．2 抗藥性監(jiān)測

本研究中各樣品采用成蟲浸葉法進(jìn)行抗藥性生測，結(jié)果見表2。從表中可以看出，山東地區(qū)煙粉虱種群對阿維菌素的抗性水平比較高（14．2倍），達(dá)到中抗水平，北京地區(qū)和湖南地區(qū)種群對其都處于敏感狀態(tài)。對于煙堿類殺蟲劑噻蟲嗪，三地種群都有不同程度的抗藥性，其中長沙地區(qū)種群對噻蟲嗪抗性水平最高，達(dá)到49．08倍，屬于高抗水平。山東濟(jì)陽和北京海淀對噻蟲嗪的抗性水平相當(dāng)，都處于中抗水平。由于所用的敏感種群對于毒死蜱不敏感，所以監(jiān)測的3個(gè)田間種群毒死蜱的抗性水平都很低。湖南地區(qū)種群對聯(lián)苯菊酯屬于低抗水平（9．64倍），山東和北京地區(qū)的煙粉虱對聯(lián)苯菊酯的抗性都 屬于敏感水平。

圖1 北京海淀、山東濟(jì)陽和湖南長沙地區(qū)煙粉虱隱種鑒定Fig．1 Identification of B．tabaci sibling species in Haidian of Beijing，Jiyang of Shandong and Changsha of Hunan

表2 北京、山東和湖南地區(qū)煙粉虱對4種殺蟲劑的抗藥性Table 2 Resistance to four insecticides of B．tabaci from Beijing，Shandong and Hunan

2．3 熒光定量

以室內(nèi)敏感種群T H－S煙粉虱為對照種群，通過熒光定量PCR分析了BJHD、SDJY和HNCS種群中CYP4v2和CYP6CX1基因的相對表達(dá)量（圖2），相對于敏感種群發(fā)現(xiàn)CYP4v2基因在3個(gè)田間種群表達(dá)量顯著提高，分別達(dá)到3．85倍，19．57倍和10．78倍，而CYP6CX1基因只是在BJHD種群中過量表達(dá)20．55倍，結(jié)果表明這兩個(gè)P450基因在煙粉虱對藥劑的田間抗性中可能起到重要作用。

3 討論

1949年，我國首次發(fā)現(xiàn)煙粉虱，由于種群密度很低未形成危害［4］。直到20世紀(jì)90年代，世界超級害蟲B隱種煙粉虱入侵我國，由于其很高的繁殖能力迅速在我國蔓延并造成嚴(yán)重的危害。而從2003年開始陸續(xù)在全國發(fā)現(xiàn)Q隱種煙粉虱，并且從2007年至今逐漸取代B隱種煙粉虱成為主要蔬菜花卉害蟲。由于煙粉虱能夠傳播眾多植物病毒，如煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒導(dǎo)致很多番茄種植大棚減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［7－9］，所以明確各地產(chǎn)生危害的煙粉虱隱種對于有效防治具有重要作用。

Q煙粉虱比B煙粉虱具有更強(qiáng)的抗藥性，在田間復(fù)雜的環(huán)境中能對多種殺蟲劑產(chǎn)生很高的抗藥性，如 Wang［11］2008年在江蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)具有1 900倍吡蟲啉抗性和1 200倍噻蟲嗪抗性的YC－Q種群，其他研究者也通過實(shí)驗(yàn)室篩選和田間采集獲得具有很高抗藥性的煙粉虱種群，表明煙粉虱具有產(chǎn)生很高抗藥性的潛力［20－21］。

圖2 田間煙粉虱的CYP4v2和CYP6CX1基因表達(dá)量Fig．2 Expression profiles of CYP4v2 and CYP6CX1 in B．tabaci from field samples

筆者采集北京、山東和湖南三地的煙粉虱樣品，對4種常用殺蟲劑進(jìn)行了毒力測定。結(jié)果表明總體上北京地區(qū)煙粉虱對于大部分藥劑的抗性水平要低于山東和湖南地區(qū)，其中對阿維菌素和聯(lián)苯菊酯的抗藥性都處于敏感水平，表明在北京地區(qū)施用這兩類殺蟲劑具有很好的防效。而對于傳統(tǒng)藥劑毒死蜱雖然抗性仍處于敏感水平，但是三地包括敏感種群的LC50值都相對比較高，表明該藥劑對于防治煙粉虱效果不佳，同時(shí)該地區(qū)煙粉虱對于煙堿類藥劑噻蟲嗪的抗性程度也不高。在2008年，Luo［10］和王少麗［20］監(jiān)測后發(fā)現(xiàn)噻蟲嗪、吡蟲啉抗性處于抵抗水平（LC50分別為6．45和4．11 mg／L），而2010年抗性達(dá)到中抗水平，2011年未發(fā)生顯著上升，可能與該地區(qū)的施藥習(xí)慣有關(guān)。山東濟(jì)陽噻蟲嗪LC50達(dá)到150．09 mg／L，抗性水平也達(dá)到7．84倍，屬于低抗水平。同時(shí)對于田間防效較好的阿維菌素抗性水平達(dá)到14．2倍，原因可能是該類殺蟲劑在山東地區(qū)大量施用后產(chǎn)生了較強(qiáng)的選擇壓力，所以促使了抗性的產(chǎn)生，該地區(qū)煙粉虱對其他藥劑的抗性水平都較低。湖南長沙2010年煙粉虱為B隱種，2011年采集的煙粉虱為Q隱種，抗性水平也顯著升高，其中以噻蟲嗪最為明顯，LC50由222．26 mg／L上升到938．46 mg／L，抗性倍數(shù)也顯著升高，表明田間Q隱種煙粉虱比B隱種煙粉虱具有更高的殺蟲劑適應(yīng)機(jī)制，對某些藥劑易形成抗藥性，所以在該地區(qū)進(jìn)行煙粉虱防治的過程中要選用有利于控制Q隱種煙粉虱的藥劑。

田間害蟲抗藥性形成機(jī)制主要有兩類，其一是殺蟲劑作用靶標(biāo)的改變，導(dǎo)致藥劑的結(jié)合能力降低，從而產(chǎn)生較高的抗藥性，如Liu［22］發(fā)現(xiàn)褐飛虱乙酰膽堿受體突變（Y151）形成了很高的吡蟲啉抗性。而另一種產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制是害蟲體內(nèi)的解毒代謝作用引起的。解毒酶在昆蟲抗藥性產(chǎn)生過程中具有重要的作用，常見的解毒酶有多功能氧化酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等，其中細(xì)胞色素多功能氧化酶P450在多種昆蟲中報(bào)道與抗性相關(guān)［23］。在煙粉虱體內(nèi)，P450與抗藥性的形成也有重要的關(guān)系，如Karunker報(bào)道的煙粉虱吡蟲啉抗性與CYP6CM1基因過量表達(dá)有關(guān)，并且通過體外降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該酶能夠代謝吡蟲啉［13－14］。Xie等通過對B隱種煙粉虱噻蟲嗪抗性和敏感品系的轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)CYP4v2基因在抗性品系中過量表達(dá)可能與煙粉虱對噻蟲嗪抗性有關(guān)［16］；Zhuang等也發(fā)現(xiàn)田間抗藥性的產(chǎn)生可能與CYP6CX1基因的過量表達(dá)有關(guān)［17］；本研究也分析了北京、山東和湖南地區(qū)煙粉虱CYP4v2和CYP6CX1基因mRNA水平的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)相對于敏感種群CYP4v2基因在3個(gè)田間種群表達(dá)量顯著提高，分別達(dá)到3．85倍，19．57倍和10．78倍，而CYP6CX1基因只是在BJHD種群中過量表達(dá)20．55倍，結(jié)果表明這兩個(gè)P450基因的過量表達(dá)可能與北京、山東以及湖南地區(qū)的煙粉虱對噻蟲嗪相對較高的抗藥性有關(guān)，同時(shí)也有可能與其他藥劑如毒死蜱、聯(lián)苯菊酯較高的LC50有關(guān)，需要通過進(jìn)一步的體外表達(dá)降解試驗(yàn)研究，來確定抗性機(jī)制。

由于田間環(huán)境的多樣性以及野外煙粉虱遺傳背景的復(fù)雜性，研究田間抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制是一個(gè)漫長而艱難的過程，需要通過進(jìn)一步的研究分析來闡述煙粉虱抗藥性的形成原因，為延緩和阻止煙粉虱的為害奠定理論基礎(chǔ)，從而更好地進(jìn)行防治工作。

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