張 勇，陸永萍，周 虹，袁 媛，湯躍躍，劉 蕊，李云燕，徐麗榮

（昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院／云南省第二人民醫(yī)院超聲科，昆明650021）

動(dòng)脈粥樣硬化是目前人類主要的健康問(wèn)題之一，飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變是動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因，其患病率呈上升的趨勢(shì)［1］。動(dòng)脈粥樣硬化是引起多種心腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)，隨著動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制和預(yù)防、治療方面研究的不斷深入，迫切需要建立一種簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好、有較典型病理改變、易于評(píng)價(jià)且適于干預(yù)治療的動(dòng)物模型。本研究選擇高脂飼料喂養(yǎng)的方法建立兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊模型，用二維超聲及病理觀察、評(píng)價(jià)兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊情況。用高頻超聲評(píng)價(jià)兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊形成的過(guò)程及情況，從而探討兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊模型制備的方法［2］。

1 材料與方法

1.1 兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊模型的建立 選取雄性日本大耳白兔80 只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。60 只兔給予高脂飼料飼養(yǎng)（配方為：1%膽固醇，7.5%蛋黃粉，8%牛油，83.5%常規(guī)飼料），自由飲水，喂養(yǎng)12 周后，開始對(duì)兔的腹主動(dòng)脈進(jìn)行超聲觀察，每2 周觀察1 次，發(fā)現(xiàn)斑塊后，詳細(xì)進(jìn)行超聲檢查及記錄，處死動(dòng)物，進(jìn)行病理檢查［3］。另選取20 只兔常規(guī)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)12 周后，超聲觀察并陸續(xù)處死動(dòng)物，約每2 周處死動(dòng)物4 只，并進(jìn)行病理切片觀察。

1.2 兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊模型的超聲評(píng)價(jià) 將兔子仰臥固定于操作臺(tái)上，胸腹區(qū)脫毛，靜脈留置針于耳緣靜脈建立靜脈通道，向靜脈內(nèi)推注3%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為1 mL／kg。麻醉成功后使用Philip iE 33 超聲診斷儀，L9-3 高頻探頭自劍下掃查，獲得腹主動(dòng)脈穩(wěn)定圖像，并觀察兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜及斑塊情況。在腹主動(dòng)脈開口2 cm處避開斑塊，測(cè)量腹主動(dòng)脈內(nèi)中膜復(fù)合體的厚度；沿兔腹主動(dòng)脈長(zhǎng)軸切面掃查，后又取橫斷切面，沿長(zhǎng)軸方向掃查，發(fā)現(xiàn)斑塊后，仔細(xì)觀察斑塊的回聲、大小、形態(tài)，對(duì)斑塊的性質(zhì)作出評(píng)價(jià)［4］。

1.3 病理切片觀察 超聲觀察后處死動(dòng)物，截取腹主動(dòng)脈，肉眼大體觀察。用10% 的中性甲醛溶液固定，然后用HE染色方法制備成病理切片，在顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 超聲觀察 模型組喂養(yǎng)過(guò)程中死亡6 只兔，培養(yǎng)成活54只。52 只動(dòng)物在12～20 周不等的喂養(yǎng)周期內(nèi)通過(guò)超聲觀察發(fā)現(xiàn)了腹主動(dòng)脈粥樣斑塊（圖1、2），有2 只兔在飼養(yǎng)觀察過(guò)程中始終未發(fā)現(xiàn)斑塊（表1）。正常組（正常喂養(yǎng)的兔）喂養(yǎng)過(guò)程中有1 只死亡，成活19 只。觀察過(guò)程中對(duì)其腹主動(dòng)脈內(nèi)中膜復(fù)合體厚度進(jìn)行測(cè)量，并與模型組比較（表2）。模型組54 只兔12 周 出 現(xiàn) 斑 塊15例，軟 斑13例，硬 斑2例；14周 增 加17例，共計(jì)32例，軟斑26例，硬斑6例；16 周增加15例，共計(jì)47例，軟斑38例，硬斑9例；18 周增加3例，共計(jì)50例，軟斑38例，硬斑10例；20 周增加2例，共52例。20 周后，所有斑塊中軟斑41例，硬斑11例。軟斑回聲顯示為中低回聲，硬斑的回聲增強(qiáng)。

表1 模型組腹主動(dòng)脈粥樣斑塊形成過(guò)程［n（%）］

表2 兩組兔主動(dòng)脈內(nèi)中膜復(fù)合體厚度比較（±s，mm）

表2 兩組兔主動(dòng)脈內(nèi)中膜復(fù)合體厚度比較（±s，mm）

＊：P＜0.05，與正常組比較。

組別 n 12 周 14 周 16 周 18 周 20 周正常組 190.8±0.140.8±0.190.9±0.230.9±0.190.9±0.22模型組 540.9±0.14＊ 1.0±0.18＊ 1.1±0.23＊ 1.2±0.19＊ 1.2±0.24＊

正常組所有兔在超聲觀察過(guò)程中未見(jiàn)明顯斑塊，12、14、16、18 周模型組腹主動(dòng)脈內(nèi)中膜復(fù)合體均高于同時(shí)期正常兔主動(dòng)脈內(nèi)中膜復(fù)合體厚度（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2。

圖1 二維超聲觀察兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊

圖2 彩色血流顯示斑塊處血流充盈缺損

2.2 病理觀察52例制備成功的模型，均經(jīng)病理切片證實(shí)，在腹主動(dòng)脈相應(yīng)部位均有斑塊形成，超聲檢查符合率100%。常規(guī)喂養(yǎng)組兔腹主動(dòng)脈柔軟有彈性。高脂飼料飼養(yǎng)組腹主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉處內(nèi)膜欠光滑，部分中斷，內(nèi)膜不均勻增厚，有淺黃色條紋發(fā)生，多處不光滑，呈凹凸不平的黃色斑塊形成，管壁僵硬。

顯微鏡下觀察：內(nèi)膜明顯增厚，其下至中膜深層均有大量泡沫細(xì)胞構(gòu)成斑塊，中膜平滑肌細(xì)胞增殖，排列紊亂，為粥樣斑塊形成。52例斑塊病理證實(shí)軟斑42例，符合率97.6%，病理特征為內(nèi)皮細(xì)胞呈長(zhǎng)橢圓形，核裸露，胞質(zhì)中可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞，線粒體腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞周圍可見(jiàn)大量膠原纖維；硬斑10例，符合率100%，病理特征為含豐富膠原的基質(zhì)及粥樣斑塊［5］（圖3）。

圖3 兔腹主動(dòng)脈斑塊病理圖片HE 染色（圖左×40，圖右×100）

3 討 論

本研究對(duì)以往喂養(yǎng)模型和觀察方法加以改進(jìn)，設(shè)計(jì)出科學(xué)合理的喂養(yǎng)方法，采用專門配方喂養(yǎng)。高脂喂養(yǎng)12 周后，超聲觀察便可發(fā)現(xiàn)兔腹主動(dòng)脈陸續(xù)有粥樣斑塊形成，到了16～20周后斑塊培養(yǎng)基本成功，成功率達(dá)96%，模型兔腹主動(dòng)脈均可見(jiàn)粥樣斑塊形成，本方法兔腹主動(dòng)脈粥樣斑塊模型建立成功。培養(yǎng)過(guò)程中以軟斑形成為主，隨著病程的延長(zhǎng)，軟斑逐漸變?yōu)橛舶摺?/p>

通過(guò)二維超聲檢查發(fā)現(xiàn)：52 只模型兔腹主動(dòng)脈可見(jiàn)粥樣斑塊形成。其余2只模型兔腹主動(dòng)脈始終未發(fā)現(xiàn)明顯斑塊。分析原因可能是：因高脂飼料喂養(yǎng)突然改變飲食結(jié)構(gòu)，在喂養(yǎng)過(guò)程中部分模型兔出現(xiàn)明顯腹瀉，高脂飼料攝入不足，吸收減少。

本研究發(fā)現(xiàn)模型制備過(guò)程中早期軟斑出現(xiàn)較多，后期硬斑發(fā)生率稍增加，但始終以軟斑為主。直到兔飼養(yǎng)到20 周前后其軟斑41例，發(fā)生率為79%。其原因可能為：（1）兔本身代謝方式的影響；（2）早期斑塊仍處于新鮮、才形成過(guò)程中；（3）沒(méi)有采取干預(yù)措施，減輕斑塊炎性反應(yīng)及血管生成，斑塊未固定［5-6］。

本研究中所有超聲確定有斑塊者后經(jīng)病理切片均證實(shí)其相應(yīng)部位有粥樣斑塊形成，二維超聲根據(jù)斑塊的回聲來(lái)確定斑塊的性質(zhì)：一般認(rèn)為中低回聲為軟斑，高回聲及強(qiáng)回聲以硬斑為主。經(jīng)病理證實(shí)其性質(zhì)基本符合，說(shuō)明超聲可準(zhǔn)確評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成及類型，在動(dòng)物模型制備過(guò)程中可作為一種無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)便的監(jiān)測(cè)工具，超聲的影像可以作為評(píng)價(jià)動(dòng)物模型制備成功與否、周期控制、喂養(yǎng)方案調(diào)整的依據(jù)。

本研究保守地從12 周后開始觀察，每?jī)芍軇?dòng)態(tài)觀察1 次至20 周。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有15例兔發(fā)生了粥樣斑塊，但何時(shí)最早出現(xiàn)，何種狀態(tài)出現(xiàn)較早，沒(méi)有記錄到，因此認(rèn)為可將其觀察周期提前，探索出最佳的喂養(yǎng)及觀察方案。

動(dòng)脈粥樣斑塊動(dòng)物模型的建立成為動(dòng)脈粥樣硬化研究中不可替代的工具。因動(dòng)物本身的生理特點(diǎn)，現(xiàn)有的模型不可能完全地復(fù)制出人類動(dòng)脈粥樣硬化的變化和病理過(guò)程。家兔的動(dòng)脈粥樣硬化模型只能在一定程度上代表人類動(dòng)脈粥樣硬化的病變。由兔的病理形態(tài)學(xué)研究中可知，兔的斑塊形態(tài)與人類斑塊的早期病變相接近，更適合做AS 發(fā)生早期機(jī)制的研究；加強(qiáng)對(duì)臨床AS 發(fā)病機(jī)制的研究，結(jié)合臨床發(fā)病機(jī)制及病變特點(diǎn)，建立更加符合人類AS 特點(diǎn)的動(dòng)物模型對(duì)AS 的診斷、治療及預(yù)防具有重大的意義［7］。

［1］ Moulton KS.Plaque angiogenesis and atherosclerosis［J］.Curr Atheroscler Rep，2011，3（3）：225-233.

［2］ Tang YY，Xie YC，Huang YL，et al.Contrast-enhanced ultrasound in assessing atherosclerosis of abdomind aorta in rabbits model：a preliminary study［J］.J Kunming Medical College，2010，31（12）：12-15.

［3］ Tsimikas S，Shaw PX.Non-invasive imaging of vulnerable plaques by molecular targeting of oxidized LDL with tagged oxidation-specific antibodies［J］.J Cell Biochem Suppl，2002（39）：138-146.

［4］ Moulton KS，Olsen BR，Sonn S，et al.Loss of collagen XⅧI enhances neovascularization and vascular permeability in atherosclerosis［J］.Circulation，2004，110（10）：1330-1336.

［5］ Hamilton AJ，Huang SL，Warnick D，et al.Intravascular ultrasound molecular imaging of atheroma components in vivo［J］.J Am Coll Cardiol，2004，43（3）：453-460.

［6］ Abdolreza Rezaie-Majd，Maca T，Robert A，et al.Simvastatin reduces expression of cytokines interleukin-6 interleukin-8，and monocyte chemoattractant protein-in circulating monocytes from hypercholesterolemic patients［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22（7）：1194-1199.

［7］ Yao CX，Yang B.Research and application of targeting microbubble contrast agent in ultrasonic diagnosis and treatment［J］.Chinese Journal of Ultrasonography，2009，18（1）：83-85.