張銀冰

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510300）

復(fù)合誘變選育細(xì)菌纖維素耐酸性高產(chǎn)菌株的研究

張銀冰*

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州510300）

首先用紫外線對出發(fā)菌株的菌體進(jìn)行誘變，然后再用硫酸二乙酯對突變株進(jìn)行誘變，最后經(jīng)篩選獲得耐酸突變株。該突變株在pH值為3.1以下生長時(shí)，產(chǎn)纖維素水平為9.2 g/L，比突變株U31提高了12.2%，比出發(fā)菌株提高了31.43%。對突變株UE26進(jìn)行傳代和穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株具有遺傳穩(wěn)定性，適宜作為研究細(xì)菌纖維素的高產(chǎn)菌株。

復(fù)合誘變；細(xì)菌纖維素；紫外線；硫酸二乙酯

由細(xì)菌生產(chǎn)的纖維素稱為細(xì)菌纖維素，也稱微生物纖維素。細(xì)菌纖維素有許多獨(dú)特的性質(zhì)，如細(xì)菌纖維素是一種“純纖維素”，具有高化學(xué)純度和高結(jié)晶度；細(xì)菌纖維素的彈性模量為一般植物纖維的數(shù)倍至十倍以上，并且抗張強(qiáng)度高；細(xì)菌纖維素有很強(qiáng)的持水能力、有較高的生物適應(yīng)性和良好的生物可降解性。因?yàn)榧?xì)菌纖維素在純度、吸水性、物力和機(jī)械性能等方面有著優(yōu)良性能，所以人們十分重視它在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究，尤其是在食品、新型傷口包扎材料、人造皮膚、聲音振動(dòng)膜、高強(qiáng)度紙、紡織纖維等領(lǐng)域，并在其他許多領(lǐng)域也顯示出十分廣泛的商業(yè)化應(yīng)用潛力。

在細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)中，為了獲取片狀成型的細(xì)菌纖維素凝膠膜，需進(jìn)行淺盤靜態(tài)發(fā)酵，而淺盤靜態(tài)發(fā)酵的最大缺點(diǎn)是容易發(fā)生雜菌污染，急需解決。降低淺盤靜態(tài)發(fā)酵的初始pH值，可有效地控制雜菌污染。但是，醋酸菌的最適pH值范圍為5.4～6.3，當(dāng)淺盤靜態(tài)發(fā)酵的初始pH值降低至3.5以下時(shí)，不利于醋酸菌生成及細(xì)菌纖維素合成。因此，需選育耐酸性高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株，使其在初始pH3.5以下能夠正常進(jìn)行細(xì)菌纖維素發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器設(shè)備

木醋桿菌Acetobater xylinum YD0705，海南億德食品有限公司提供；硫酸二乙酯，上海啟迪化工有限公司；營養(yǎng)瓊脂、椰子水、酵母膏、氯化氨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀均為市購。

HWY211恒溫震蕩培養(yǎng)箱、干燥箱、紫外燈、恒溫水浴箱、250 mL三角瓶、顯微鏡、試管（帶塞）、血球計(jì)數(shù)板、培養(yǎng)皿、移液管、電子天平、滅菌鍋、涂布棒、酒精燈、接種環(huán)、玻璃棒、燒杯、量筒、分餾裝置、電爐、PH計(jì)、溫度計(jì)、酒精計(jì)、膠頭滴管、洗耳球、玻片、棉塞、膠塞、測微尺、錐形瓶、紗布、鐵架臺。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配置

斜面培養(yǎng)基：椰子水400 mL，營養(yǎng)瓊脂13.2 g，自然pH，分裝試管中，121℃滅菌20 min。

富集培養(yǎng)基：椰子水300 mL，氯化氨1.2 g，硫酸鎂0.15 g，磷酸二氫鉀0.45 g，自然pH，分裝2瓶，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：椰子水150mL，菠蘿皮汁150mL，氯化氨1.2g，硫酸鎂0.15 g，磷酸二氫鉀0.45 g，自然pH，分裝2瓶，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：菠蘿皮汁120 mL，酵母膏2 g，蔗糖15 g，氯化氨1.2 g，硫酸鎂0.15 g，磷酸二氫鉀0.45 g，pH4.5，分裝2瓶，121℃滅菌20 min。

1.2.2 誘變流程

木醋桿菌→搖瓶培養(yǎng)→菌懸液制備→紫外線誘變→酸性平板初篩→發(fā)酵復(fù)篩→斜面→菌懸液制備→酸性二乙酯誘變→酸性平板初篩→發(fā)酵復(fù)篩→斜面→傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)和菌種特征考察→菌種保藏。

1.2.3 斜面培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基接種后，30℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.2.4 平板培養(yǎng)

平板培養(yǎng)基接種后，30℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.2.5 搖瓶培養(yǎng)

將100 mL富集培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，用8層紗布包扎瓶口，滅菌后冷卻至30℃，接入菌種，恒溫30℃、120℃轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)16 h。

1.2.6 發(fā)酵

在無菌操作的環(huán)境下，將種子液搖勻倒進(jìn)20 mL量筒（已經(jīng)滅菌），然后迅速倒入裝有100 mL培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后在30℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d后收集纖維素。

1.2.7 菌懸液的制備

取1.2.5所得的培養(yǎng)液，于4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無菌的pH7.0磷酸緩沖液離心洗滌菌體2次，再將菌體轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，以適量的pH7.0磷酸緩沖液與菌體混合，充分振蕩，制成菌懸液，通過菌體計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)為106cfu/mL。

1.2.8 木醋桿菌菌懸液的紫外線誘變

誘變箱的紫外燈位15 W，照射距離為21 cm，波長253.7 nm，照射前開啟紫外燈預(yù)熱20 min，使紫外線強(qiáng)度穩(wěn)定。取1.2.7制備的菌懸液放入帶磁力攪拌棒的無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿20 mL，照射時(shí)間分別為：30 s、60 s、90 s、120 s、150 s。照射后，取0.1 mL涂布在培養(yǎng)基pH分別為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0的平板30℃恒溫培養(yǎng)24 h。以未經(jīng)紫外線處理的菌懸液為對照，測定不同照射時(shí)間的致死率。以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，做致死曲線。

1.2.9 菌體的DES誘變

分別取20 mL的木醋桿菌的菌懸液置于6個(gè)250 mL的三角瓶中，添加硫酸二乙酯，使其體積濃度達(dá)到0.5%，然后在30℃，100 r/min分別處理1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，振蕩培養(yǎng)結(jié)束后立即加入質(zhì)量濃度25%的硫代硫酸鈉5 mL，以終止反應(yīng)。然后將菌懸液稀釋，稀釋度分別為10-3、10-4、10-5，每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板，以上操作均在紅燈下進(jìn)行，平板用黑布包好，在30℃培養(yǎng)48 h。以未加DES但經(jīng)同樣處理的作為對照組，以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，做致死曲線。

1.2.10 發(fā)酵初篩

從經(jīng)過誘變的培養(yǎng)液中隨機(jī)挑取15株單菌落轉(zhuǎn)接到pH為3.5的斜面富集培養(yǎng)基上，再將活化后的菌種接種到盛有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，每株2瓶，30℃恒溫培養(yǎng)7 d，至于搖床上發(fā)酵，選取高產(chǎn)斜面進(jìn)行復(fù)篩。出發(fā)菌株同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以便比較。

1.2.11 發(fā)酵復(fù)篩

初篩后的誘變菌株和對照組一起，轉(zhuǎn)入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩。比較其產(chǎn)量，挑出耐酸高產(chǎn)菌株。

1.2.12 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將選育所的突變株傳代10次，測定這10次纖維素產(chǎn)量，確定誘變菌株產(chǎn)量是否穩(wěn)定。只有纖維素產(chǎn)量穩(wěn)定的誘變菌株才是試驗(yàn)得到的理想高產(chǎn)菌株。

1.2.13 致死率的測定

將誘變處理的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布平板，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以未經(jīng)誘變處理的菌懸液做對照，計(jì)算致死率：

致死率=（1-誘變后活菌數(shù)/誘變前活菌數(shù)）×100%

1.2.14 纖維素產(chǎn)量的測定

細(xì)菌纖維素持水性極強(qiáng)，以濕重衡量其產(chǎn)量誤差較大，需采用干纖維素絕對產(chǎn)量和干纖維素產(chǎn)出水平進(jìn)行比較，干纖維素產(chǎn)出水平是每升培養(yǎng)液含油的干纖維素質(zhì)量，其單位為g/L。測定方法為：取出浮在表面的細(xì)菌纖維素，用大量水沖洗，去除細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基等雜質(zhì)，再將其浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液中，100℃煮沸20 min，去除殘留在內(nèi)部的菌體和培養(yǎng)基。然后，用蒸餾水洗滌、浸泡，使浸泡水pH值達(dá)到7.0～7.2，置于105℃干燥至恒重，稱重可得纖維素干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外線對菌懸液的誘變條件

菌懸液用紫外線誘變處理，不同時(shí)間下的致死率如圖1所示。圖1表明，紫外線照射時(shí)間越長，致死率越高；當(dāng)紫外線照射時(shí)間為90 s時(shí)，致死率為78.2%。大量文獻(xiàn)認(rèn)為，較低致死率下進(jìn)行誘變處理，其正突變率更高，目前傾向于選擇致死率為70%～80%的誘變劑量，故本試驗(yàn)選擇90s作為紫外線誘變時(shí)間。

圖1 紫外誘變的致死曲線

2.2 紫外線對菌體的誘變結(jié)果

采用紫外線處理過的菌體誘變培養(yǎng)之后，采用酸性平板預(yù)篩，其耐酸情況如圖2所示。

圖2 出發(fā)菌株和突變菌株U在酸性平板上的分布

從圖2可以看出，出發(fā)菌株和突變菌株在酸性平板上生長，其菌數(shù)隨pH值的降低而減少。當(dāng)平板培養(yǎng)基pH值低于3.3時(shí)，平板上幾乎看不到出發(fā)菌株，而突變菌株在pH值低于2.8 h才不生長。因此，經(jīng)過紫外誘變能夠大幅度提高突變株的耐酸性。

通過將pH值為3.5的平板上的菌落采用富集培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)與觀察，從中挑出菌落較大的80銖?fù)蛔冎?，與出發(fā)菌株同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，從中篩選出10株產(chǎn)纖維素較高的突變株，其產(chǎn)纖維素情況如圖3所示。從圖3可以看出，在pH值為3.5的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，由于出發(fā)菌株耐酸性能較差，其生長速度和產(chǎn)纖維素較低，產(chǎn)纖維素水平僅為7.1 g/L；而10株突變菌株的耐酸性能較強(qiáng)，產(chǎn)纖維素水平都高于出發(fā)菌株，其中突變株U31產(chǎn)纖維素水平最高，達(dá)到8.3 g/L，比出發(fā)菌株提高了16.9%，故選為進(jìn)一步誘變處理的菌株。

圖3 出發(fā)株與突變株U在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)纖維素水平

2.3 DES對菌體的誘變條件

以突變株U6制備菌懸液，然后采用DES誘變處理，不同時(shí)間下的致死率如圖4所示。圖4表明，體積濃度0.5%硫酸二乙酯對菌體有致死作用，且處理時(shí)間越長，致死率越高。目前傾向于選擇致死率為70%～80%的誘變劑量。在本試驗(yàn)中，處理時(shí)間為3 min時(shí)致死率為79%，故選為誘變時(shí)間，有利于獲得更高的正突變率。

圖4 DES誘變致死曲線

2.4 DES對菌體的誘變結(jié)果

采用DES處理過的突變株U6經(jīng)過誘變后培養(yǎng)之后，采用酸性平板預(yù)篩，其耐酸情況如圖5所示。

圖5 突變株U與突變株E在酸性平板上的分布

從圖5可以看出，經(jīng)DES誘變后，可進(jìn)一步提高菌株的耐酸性能，所得突變株E在酸性平板上的生長情況比突變株U6更好。通過將PH值為3.1的酸性平板上的菌落用富集培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和觀察，從平板上挑出菌落較大的80株突變株，與出發(fā)菌株F0和突變株U31同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。從中篩選出10株產(chǎn)纖維素較高的突變株，其產(chǎn)纖維素情況如圖6所示。

圖6 出發(fā)株、突變株U與突變株E的產(chǎn)纖維素水平

從圖6可以看出，在pH值為3.1的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，由于出發(fā)菌株耐酸性能較差，其生長速度和產(chǎn)纖維素略有下降，產(chǎn)纖維素水平僅為7.0 g/L；而10株突變菌株的耐酸性能較強(qiáng)，產(chǎn)纖維素水平都高于出發(fā)菌株和突變株U31，其中突變株E26產(chǎn)纖維素水平最高，達(dá)到9.2 g/L，比突變株U提高了12.2%，故選為進(jìn)一步試驗(yàn)的菌株。

2.5 突變株的遺傳穩(wěn)定性

將篩選所得的突變株UE26在傳代10次，每代都在每代都在pH值為3.1以下的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，其發(fā)酵產(chǎn)纖維素水平穩(wěn)定，可作為發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)菌株。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用傳統(tǒng)的紫外誘變育種方法選育細(xì)菌維素高產(chǎn)菌株是很有效的方法，經(jīng)紫外誘變得到的突變株可在pH值為3.5以下生長，該突變株產(chǎn)纖維素水平比出發(fā)菌株F0提高了16.9%。在紫外誘變的基礎(chǔ)上，利用硫酸二乙酯進(jìn)行復(fù)合誘變，可進(jìn)一步提高產(chǎn)纖維素水平，比突變株E31提高了12.2%；比出發(fā)菌株提高了31.43%，傳代和穩(wěn)定性良好，適宜作為研究細(xì)菌纖維素的高產(chǎn)菌株。為了應(yīng)用于生產(chǎn)，還需進(jìn)一步對該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化試驗(yàn)。

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Study on the selection ofhigh-yield and acid resistance by complex mutation ofbacterialcellulose

ZHANGYin-bing
（Guangdong industry technical college，Guangdong Guangzhou 510300，China）

The initial mutant population was generated bydiethyl sulfate（DES）treat，and then the protoplast ofmutant was subjected to the ultraviolet radiation，finally，an improved population with acid resistance was successfully screened.Its maximum acid resistance pH was 3.1，the maximal cellulose was reached 9.2 g/L，compared mutant U31 improved by12.2%，there were an 31.43%increase on the base ofthe existing strains.The mutations UE26 batches and stabilitytest，the results showthat the strain has the genetic stability，suitable as high-yield strains ofbacterial cellulose.

complex mutation；bacterial cellulose；ultraviolet；ethyl sulfate

TS261.1+3

A

1673-6044（2014）02-0042-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.02.015

*張銀冰，女，1979年出生，2009年畢業(yè)于華南理工大學(xué)生物工程專業(yè)，講師。

2014-03-21