劉芳梅　張繼紅　閆婷婷

【摘要】 目的：研究Pim-1基因及其蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達水平，探討其與宮頸鱗癌臨床特性之間的關(guān)系。方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）半定量方法和免疫組化學法，檢測46例宮頸鱗癌組織和10例正常宮頸組織標本中Pim-1基因及蛋白的表達情況。結(jié)果：宮頸鱗癌組織中Pim-1基因與蛋白的表達水平明顯高于宮頸正常組織（P<0.05）；Pim-1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達與組織學分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：原癌基因Pim-1及其蛋白在宮頸鱗癌組織中過度表達，可能與宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 宮頸鱗癌； 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)； 免疫組化； Pim-1基因

Pim-1基因最早在莫洛尼小鼠白血病病毒誘導的T-細胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)的[1]，其編碼的Pim-1蛋白激酶具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化與凋亡等。已有大量的研究表明Pim-1在人類多種腫瘤組織中高表達。但關(guān)于Pim-1在宮頸癌組織中的表達情況研究報道甚少。本研究應(yīng)用RT-PCR方法和免疫組化學法分別檢測了Pim-1基因和其蛋白在宮頸鱗癌中的表達情況，初步探討了Pim-1基因與宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并且為以后深入研究提供了相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 所有標本均來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2009-2011年手術(shù)治療且術(shù)后經(jīng)病理科證實為宮頸鱗癌患者46例（惡性組）、多發(fā)性子宮平滑肌瘤患者10例（正常組），所選患者術(shù)前均未進行放療和化療。取所有入選病例術(shù)中切除的新鮮宮頸組織標本，均分作兩份，一份立即放入液氮中保存，用于做RT-PCR實驗；另一份用福爾馬林溶液固定、石蠟包埋，用于做免疫組化實驗。

1.2 試劑 RT-PCR所用試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物是由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成：Pim-1上游引物序列為5' CGATGGGACCCGAGTGTA 3'，下游引物序列為5' TGGAGGTGGATCTCAGCAGT 3'，擴增片段為312 bp；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5' CTGGGACGACATGGAGAAAA 3'，下游引物序列為5' AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3'，擴增片段為564 bp。SP試劑盒和DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人單克隆抗體Pim-1購于美國EPITOMICS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR 取約100 mg宮頸組織，按Trizol提取試劑盒說明提取各組織總的RNA，紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ?L，按PCR試劑盒說明進行。Pim-1引物擴增條件為：94 ℃預變性2 min，1個循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取上述擴增產(chǎn)物5 ?L與緩沖液混合后加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進行電泳。EB染色，用紫外線投射儀觀察電泳條帶，拍照并記錄，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進行分析，得出Pim-1 mRNA相對表達量。以正常宮頸組織作為對照。

1.3.2 免疫組化 采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法檢測Pim-1蛋白的表達，具體操作按試劑盒說明書進行。染色結(jié)果判定：Pim-1在光鏡下進行分析，隨機選擇5個高倍視野共計數(shù)200個細胞，在排除非特異性染色的前提下，胞漿/胞核出現(xiàn)淡黃色至黃棕色或棕褐色為陽性染色。計分方法：（1）染色程度：無著色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，黃棕或棕褐色計3分；（2）陽性細胞百分率≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，≥76%計4分。評判標準（A×B）≤1為陰性表達，>1為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織中Pim-1基因及蛋白的表達 Pim-1基因在宮頸鱗癌組織中的表達水平為（1.361±0.122），明顯高于正常宮頸組織的（0.023±0.002），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Pim-1蛋白在宮頸鱗癌組織中陽性表達例數(shù)為35例（76.1%），高于正常宮頸組織的3例（30.0%），差異有統(tǒng)計學意義（字2=6.026，P=0.014）。

2.2 宮頸鱗癌中Pim-1蛋白的表達與臨床特征的關(guān)系 Pim-1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達與組織學分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。見表1。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因調(diào)控的長期過程，隨著早期診斷技術(shù)不斷進步如液基細胞學檢測及陰道鏡等[2-3]，很多宮頸癌前病變得到早期診斷和治療，從而降低了宮頸癌的發(fā)病率，治療上除了手術(shù)、放化療、藥物治療等，介入治療也在宮頸癌的治療中得到廣泛應(yīng)用[4-5]，治療方案更加合理化，死亡率也得到了明顯下降，然而宮頸癌治療后仍然存在著復發(fā)和轉(zhuǎn)移，甚至導致病死。故繼續(xù)探索宮頸癌的疾病發(fā)生、發(fā)展的機制，積極尋找新的診斷、治療靶點具有重要意義。

國內(nèi)外研究證實Pim-1參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化與凋亡，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，例如He等[6]和張彤等[7]研究指出用QRT-PCR檢測Pim-1 mRNA，可為診斷前列腺癌提供一個可靠的標準，提示Pim-1在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能成為前列腺癌診斷和預后判斷的標志物；李曉晶等[8]研究表明Pim-1在肺癌組織中高表達，并且與腫瘤的直徑和TNM分期呈正相關(guān)，提示Pim-1與肺癌的發(fā)生和發(fā)展程度有關(guān)；Yi等[9]發(fā)現(xiàn)Pim-1在非小細胞肺癌組織中高表達，可能在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。同時，隨著研究的深入，以Pim-1為腫瘤治療靶點的研究也日益引起了眾多學者的關(guān)注，例如Mumenthaler等[10]發(fā)現(xiàn)Pim激酶抑制劑與化療聯(lián)合可以改善前列腺癌在臨床治療中的耐藥情況；Shengjie等[11]研究發(fā)現(xiàn)沉默Pim-1可以明顯抑制膀胱癌細胞生長，并且可以增強膀胱癌細胞在體外對化療藥物的敏感性。本實驗結(jié)果表明Pim-1基因及其編碼的蛋白在宮頸鱗癌組織中表達水平均明顯高于正常宮頸組織，提示Pim-1與宮頸鱗癌的發(fā)生有關(guān)。在對Pim-1蛋白與宮頸鱗癌病例臨床特征進行分析后發(fā)現(xiàn)Pim-1蛋白表達水平與宮頸鱗癌分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)呈正相關(guān)，進一步提示Pim-1可能在一定程度上可以反映宮頸鱗癌的進展情況，為臨床預測宮頸鱗癌的預后提供一定的理論依據(jù)。但由于本實驗病例及實驗方法的局限性，Pim-1與宮頸癌的具體關(guān)系及機制仍有待于進一步的研究與探討。

綜上所述，Pim-1可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并且可能成為宮頸鱗癌診斷和預后判斷的標志物，另外以Pim-1為靶點的治療方法有可能為臨床治療宮頸鱗癌開辟一條新的路徑。

參考文獻

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（收稿日期：2013-12-12） （本文編輯：蔡元元）

綜上所述，Pim-1可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并且可能成為宮頸鱗癌診斷和預后判斷的標志物，另外以Pim-1為靶點的治療方法有可能為臨床治療宮頸鱗癌開辟一條新的路徑。

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（收稿日期：2013-12-12） （本文編輯：蔡元元）

綜上所述，Pim-1可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并且可能成為宮頸鱗癌診斷和預后判斷的標志物，另外以Pim-1為靶點的治療方法有可能為臨床治療宮頸鱗癌開辟一條新的路徑。

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（收稿日期：2013-12-12） （本文編輯：蔡元元）