李和平 鄒 琦 商 蘭 劉偉石

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

離子載體是指可以整合到細(xì)胞膜上，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)或通透離子的一類膜活性分子［1］。大多數(shù)離子載體是細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素，其作用機(jī)制就是提高了靶細(xì)胞膜通透性，使得靶細(xì)胞無法維持細(xì)胞內(nèi)離子的正常濃度梯度而死亡，所以離子載體并非是自然狀態(tài)下存在于膜中的運(yùn)輸?shù)鞍?，而是人工用來研究膜運(yùn)輸?shù)鞍椎囊粋€(gè)概念。與其它多數(shù)抗生素不同，由于這一類分子的獨(dú)特性質(zhì)，其被廣泛用于生物膜功能的研究［1］。

鈣離子載體A23187 是一種從微生物中分離出的抗生素，屬于游離羧基酸?！熬禹旙w反應(yīng)(AR)是Ca2+依賴過程”［2］的發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致了鈣離子載體(A23187)在精子頂體反應(yīng)過程中的應(yīng)用［3］331。A23187 可以結(jié)合細(xì)胞外的Ca2+、Mg2+等金屬陽離子形成復(fù)合物，攜帶離子內(nèi)流進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，從而誘發(fā)精子的頂體反應(yīng)并激活頂體酶［3］331。自Roldan和Harrison［4］率先采用A23187 處理羊精子引起頂體反應(yīng)以來，諸多學(xué)者曾先后使用A23187 進(jìn)行了誘發(fā)樹鼩［5］、狗［6］、小鼠［7］等動物和人［8］精子頂體反應(yīng)的研究。

本研究以鈣離子載體(A23187)誘發(fā)馬鹿(Cervus elaphus)精子頂體反應(yīng)，旨在摸索A23187 在體外誘發(fā)馬鹿精子頂體反應(yīng)的適宜體系，為鹿的體外繁殖技術(shù)提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 精液來源

馬鹿新鮮精液以人工采精的方法采自黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院哈爾濱特產(chǎn)研究所種鹿場的成年健康種公鹿。采得的新鮮精液用AndroMed 稀釋液(德國米尼圖公司生產(chǎn))稀釋后，于細(xì)管中分裝，0 ～4 ℃保存不超過5 d。

1.2 試劑

A23187、BSA、肝素、Penicillin G、Streptomycin sulfate、Na－Pyruvate、Glucose、NaCl、KCl、KH2PO4、NaHCO3、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4、臺盼藍(lán)均購自SIGMA 公司;Phenol Red 購自ALDRICH 公司;DMSO(分裝)購自AMRESCO 公司;俾士麥棕Y 購自CHROMA 公司;玫瑰紅B、戊二醛、乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要操作液

精子體外獲能培養(yǎng)液:BO 基礎(chǔ)液按照細(xì)胞培養(yǎng)用液的要求配制。洗精液為BO 基礎(chǔ)液+6 g/L BSA，獲能液為BO 基礎(chǔ)液+6 g/L BSA+20 mg/L 肝素;各液均為使用前配制，0.22 μm 濾器過濾除菌后，于CO2培養(yǎng)箱(MCO－15AC SANYO)中平衡4 h以上使用;各種培養(yǎng)液均用滅菌超純水配制。

A23187 配制:A23187 用DMSO 溶解，配制成10 mol/L 濃縮液，－20 ℃保存，使用前逐級稀釋至所需濃度;配制過程中注意避光。

染色與固定液:臺盼藍(lán)使用體積分?jǐn)?shù)為1%，用BO 基礎(chǔ)液充分溶解后，用前離心去除雜質(zhì)后使用，pH=7.4;俾士麥棕Y 使用體積分?jǐn)?shù)為0.4%，用30%乙醇溶解，調(diào)節(jié)pH 值至2.8，40 ℃加熱使其充分溶解，使用前過濾;玫瑰紅B 使用體積分?jǐn)?shù)為0.8%，用0.1 mmol/L Tris 溶解，調(diào)節(jié)pH 值至5.3，使用前過濾;戊二醛固定液體積分?jǐn)?shù)為3%，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制，pH=7.4。

1.4 試驗(yàn)方案

采用上浮法，以BSA、肝素誘導(dǎo)精子體外獲能;精子獲能后，用BO 基礎(chǔ)液+6 g/L BSA 將精子懸液稀釋至合適濃度，分組，分別加入鈣離子載體(A23187)，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，誘導(dǎo)其發(fā)生頂體反應(yīng)。A23187 誘發(fā)精子頂體反應(yīng)的培養(yǎng)液終濃度分別為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 μmol/L，共10 組，作用時(shí)間均為5 min，以篩選 A23187 的適宜濃度。以篩選出的A 23187適宜濃度為基礎(chǔ)，繼之設(shè)計(jì)作用時(shí)間從0.5、2.0、5.0、7.0、10.0、15.0 min 的6 個(gè)組，確定A23187 的適宜作用時(shí)間。另外，以篩選出的A23187 適宜作用濃度和時(shí)間為基礎(chǔ)，將經(jīng)過離心去除精清和保護(hù)劑等成分的精子懸浮于含A23187 的培養(yǎng)液中，研究A23187 誘發(fā)未獲能馬鹿精子頂體反應(yīng)的效果。

1.5 結(jié)果檢測與統(tǒng)計(jì)處理

采用三色染色法對頂體反應(yīng)發(fā)生的效果進(jìn)行檢測，頂體反應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照圖1進(jìn)行。精子頂體反應(yīng)的檢測、頂體反應(yīng)率的計(jì)算及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理的具體方法按照劉偉石等［9］的方法進(jìn)行。

圖1 馬鹿精子頂體反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)參照圖

2 結(jié)果與分析

2.1 A23187 作用濃度的篩選

由表1可見，添加A23187 后，各組頂體反應(yīng)率均有所升高;添加終濃度為10 μmol/L A23187 組頂體反應(yīng)率最高為(77.94±1.35)%，其次是0.10 μmol/L A23187 組為(74.00±2.62)%，但是，精子活率前者(39.38±3.59)%低于后者(78.84±4.25)%，二者精子活率差異顯著(P＜0.05)。與對照組(不添加A23187 組)相比較，100.00、50.00、10.00、0.50、0.10、0.05、0.01 μmol/L A23187 組頂體反應(yīng)率差異顯著(P ＜0.05)。隨著A23187 濃度的升高，精子活率逐漸下降，與對照組比較0.50、0.10、0.05、0.01 μmol/L A23187 組，差異不顯著(P＞0.05)，其他組差異顯著(P＜0.05)。

2.2 A23187 作用時(shí)間篩選

由表2可見，以0.10 μmol/L A23187 誘發(fā)馬鹿精子頂體反應(yīng)，15.0 min 內(nèi)，頂體反應(yīng)率先逐漸升高，至5.0 min 時(shí)達(dá)到最高值，然后又逐漸下降。5.0 min 時(shí)，頂體反應(yīng)率與其他組比較，差異顯著(P＜0.05)，其他組之間比較差異不顯著(P＞0.05)。

表1 A23187 誘發(fā)馬鹿精子頂體反應(yīng)適宜作用濃度的篩選結(jié)果

表2 A23187 誘發(fā)馬鹿精子頂體反應(yīng)適宜作用時(shí)間的篩選結(jié)果

2.3 A23187 誘發(fā)未獲能馬鹿精子頂體反應(yīng)的作用

以含有終濃度為0.10 μmol/L A23187 的BO 基礎(chǔ)液處理未獲能馬鹿精子5.0 min 后，精子頂體反應(yīng)率為(24.31±3.76)%;獲能后，使用0.1 μmol/L A23187 誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)率為(77.54±0.97)%，二者差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

A23187 作用強(qiáng)烈，處理時(shí)間過長或濃度過高會導(dǎo)致精子急劇死亡［3］331。誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)后，如果不去除培養(yǎng)液中的A23187，37 ℃水浴條件下，臺盼藍(lán)染色15.0 min，也可能繼續(xù)誘導(dǎo)精子進(jìn)行頂體反應(yīng)的過程。根據(jù)離心洗滌精漿去獲能因子的方法，在本研究試驗(yàn)方案中，還設(shè)計(jì)了離心洗滌去除BSA 與A23187，探討不同處理方法對精子活率和頂體反應(yīng)率的影響，但本研究結(jié)果表明，獲能后離心，精子活力變化不大(P＞0.05)。雖然精子頂體反應(yīng)后比較脆弱，頂體反應(yīng)后離心，對精子影響很大，精子活力和活率會明顯下降［10］，但由于在本試驗(yàn)中計(jì)算頂體反應(yīng)率時(shí)，只計(jì)算活精子中發(fā)生頂體反應(yīng)的精子數(shù)，精子頂體反應(yīng)后離心，頂體反應(yīng)率差異不顯著(P＞0.05)，離心對頂體反應(yīng)率無影響。因此，本研究在后續(xù)的A23187 作用濃度和時(shí)間試驗(yàn)中均采用獲能和頂體反應(yīng)后不離心的方法處理精子。

旭日干等［11］和陳大元［3］332指出用A23187 處理牛、羊精子應(yīng)不加BSA。A23187 屬于羧基酸，BSA參與介導(dǎo)堿性組胺的釋放，可能會弱化A23187 的作用。但是，Jaiswal 等［12］使用A23187 誘導(dǎo)人精子頂體反應(yīng)的結(jié)果表明，血清對獲能和完全頂體反應(yīng)是必須的，而對部分頂體反應(yīng)則不是必須的。本試驗(yàn)方案所使用含有和不含BSA 的獲能液使精子獲能，A23187 誘導(dǎo)頂體反應(yīng)后，結(jié)果表明二者差異不顯著(P＞0.05)，證明BSA 對A23187 誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的弱化作用并不影響馬鹿精子頂體反應(yīng)率，因此本研究的后續(xù)試驗(yàn)中均采用含有BSA 的獲能液使精子獲能。

在其他物種(包括人類)中，已經(jīng)廣泛地使用A23187 誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)。但是，使用的A23187濃度和誘導(dǎo)時(shí)間有很大差異。如Ucar 等［13］用0.1、1.0 μmol/L A23187 孵育羊精子45、60 min，Cao 等［5］用5、10 μmol/L A23187 處理樹鼩精子1～2 h，Jaiswal 等［8］使用10 μmol/L A23187 誘導(dǎo)人精子30 min，Picherit－Marchenay 等［14］使用10 μmol/L A23187 孵育人精子45 min，都使精子發(fā)生了頂體反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，精子獲能后，使用0.10、10.00 μmol/L A23187 處理5 min，頂體反應(yīng)率為74.00%和77.94%，二者比較，差異不顯著(P＞0.05)，但與對照組比較，差異均顯著(P ＜0.05)，然而10.00 μmol/L A23187 處 理 組，精 子 活 率 低，與0.10 μmol/L A23187 處理后精子活率比較，差異顯著(P ＜0.05)?？紤]到活率因素，本試驗(yàn)中0.10 μmol/L A23187 比10.00 μmol/L A23187 更適宜做后續(xù)的A23187 作用時(shí)間和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等精子受精生物學(xué)方面的研究。

使用0.10 μmol/L A23187 處理馬鹿精子，5 min時(shí)頂體反應(yīng)率最高，與本試驗(yàn)方案中其他作用時(shí)間的頂體反應(yīng)率相比較，差異顯著(P＜0.05);其他作用時(shí)間之間比較，頂體反應(yīng)率差異均不顯著(P＞0.05)。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，A23187 處理馬鹿精子時(shí)間均采用了5 min。

另外，在本試驗(yàn)中，采用了100.00、50.00 μmol/L 的高濃度A23187 誘導(dǎo)馬鹿精子頂體反應(yīng)，頂體反應(yīng)率與對照組差異顯著(P＜0.05)，該濃度的應(yīng)用未見報(bào)道。但是，100.00、50.00 μmol/L A23187 作用后精子活率明顯下降，與其他組差異顯著(P＜0.05)。

總之，通過本研究得出:0.01～100.00 μmol/L 的A23187 可提高獲能馬鹿精子的頂體反應(yīng)率，其中適宜的A23187 濃度為0.10 μmol/L，且0.10 μmol/L A23187 誘導(dǎo)馬鹿精子頂體反應(yīng)的時(shí)間以5 min 為宜。

［1］ 馬學(xué)海，施玉梁.哺乳動物及人精子膜離子通道的研究進(jìn)展［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1998，29(2):109－114.

［2］ Yanagimachi R. The movement of golden hamster spermatozoa before and after capacitation［J］. J Reprod Fert，1970，23(1):193－196.

［3］ 陳大元.受精生物學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2000.

［4］ Roldan E R，Harrison R A. Polyphosphoinositide breakdown and subsequent exocytosis in the Ca2+/ionophore-induced acrosome reaction of mammalian spermatozoa［J］. Biochem J，1989，259(2):397－406.

［5］ Cao Xiaomei，Ben Kunlong，Wang Yuqi，et al. Effects of γ-aminobutyric acid，progesterone and ionophore A23187 on acrosome reaction of tree shrew sperm in vitro:examination of acrosome reaction with an improved fluorescence microscopy［J］. Animal Reproduction Science，1997，49(2/3):225－234.

［6］ Szász F，Cheng F P，Marks A，et al. Induction of acrosome reaction in dog sperm by calcium ionophore［J］. Acta Vet Hung，1997，45(2):177－187.

［7］ Fraser L R，McDermott C A. Ca2+-related changes in the mouse sperm capacitation state:a possible role for Ca2+-atpase［J］. J Reprod Fertil，1992，96(1):363－377.

［8］ Jaiswal B S，Eisenbach M，Tur-Kaspa I. Detection of partial and complete acrosome reaction in human spermatozoa:which inducers and probes to use［J］. Molecular Human Reproduction，1999，5(3):214－219.

［9］ 劉偉石，李和平，鄒琦，等.γ-氨基丁酸誘發(fā)馬鹿精子頂體反應(yīng)［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37(9):95－101.

［10］ 秦鵬春.哺乳動物胚胎學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:94－107，444－453.

［11］ 旭日干，張鎖鏈，薛曉先，等.屠宰母牛卵巢卵母細(xì)胞體外受精與發(fā)育的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1989，20(3):193－198.

［12］ Jaiswal B S，Cohen-Dayag A，Tur-Kaspa I，et al. Sperm capacitation is，after all，a prerequisite for both partial and complete acrosome reaction［J］. FEBS Lett，1998，427(2):309－313.

［13］ Ucear O，Parkinson T J. In vitro induction of the acrosome reaction in ovinespermatozoa by calcium ionophore A23187［J］. Acta Vet Hung，2003，51(1):103－109.

［14］ Picherit-Marchenay C，Bréchard S，Boucher D，et al. Correlation between tyrosine phosphorylation intensity of a 107 kDa protein band and A23187-induced acrosome reaction in human spermatozoa［J］. Andrologia，2004，36(6):370－377.