張 凱 王 琪

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (黑龍江省森林保護(hù)研究所)

何冬明 李媛媛 嚴(yán)善春 曲鳳靜 宋大北

(青島冠中生態(tài)股份有限公司) (東北林業(yè)大學(xué)) (內(nèi)蒙古克什克騰旗林業(yè)局)

在昆蟲(chóng)與植物的相互作用中，植物形成了一套完整的防御體系，化學(xué)防御在植物抵抗外界壓力中發(fā)揮著重要作用［1］，其中次生代謝物質(zhì)被認(rèn)為是昆蟲(chóng)主要的化學(xué)防御物質(zhì)［2］。酚酸是植物與抗蟲(chóng)性有關(guān)的重要次生物質(zhì)［3-4］，也是合成植物毒素的前體物質(zhì)［5］。植物體內(nèi)酚酸類(lèi)物質(zhì)含量的高低與昆蟲(chóng)數(shù)量及蟲(chóng)害侵染程度存在一定的相關(guān)性［6-7］。植物受外界脅迫時(shí)能夠引發(fā)其酚酸類(lèi)化合物的合成［8-10］。

黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)又稱(chēng)黃波欏，是東北三大硬闊之一。一直以來(lái)有關(guān)黃檗病蟲(chóng)害大發(fā)生和危害的報(bào)道很少。在本研究的前期調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，黃波欏麗木虱(Calophya nigra Kuwayama)［11］對(duì)黃檗的危害較重，其若蟲(chóng)在葉部刺吸樹(shù)液致使樹(shù)葉萎縮變形，同時(shí)若蟲(chóng)從肛門(mén)不斷排出大量的含糖糞便，由此誘發(fā)煤污病造成大量葉片萎縮潰爛，影響樹(shù)木生長(zhǎng)和發(fā)育。6月份，黃檗的植株及葉片危害率相對(duì)較低，7月份被害率明顯升高，雌株被害率甚至高達(dá)90%以上(見(jiàn)表1)?？梢?jiàn)，黃檗同樣會(huì)遭受蟲(chóng)害侵染，且不同生長(zhǎng)時(shí)期的受害程度有明顯差別。本研究測(cè)定不同性別、不同樹(shù)齡及不同生長(zhǎng)時(shí)期的健康和受害黃檗葉片內(nèi)酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，分析酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與黃檗抗蟲(chóng)性之間的關(guān)系，為黃檗人工林的有效管理和害蟲(chóng)防治提供理論參考。

表1 不同月份調(diào)查樣地的黃檗植株被害率

1 材料與方法

1.1 植物材料

由于在5月底，黃波欏麗木虱的若蟲(chóng)較少，對(duì)植株沒(méi)有造成明顯的危害，而9月底黃檗已開(kāi)始大量落葉［12-13］，且此時(shí)若蟲(chóng)已發(fā)育為成蟲(chóng)，不再對(duì)黃檗進(jìn)行危害。因此，本研究將6月、7月和8月3 個(gè)月份的樣葉作為試驗(yàn)材料。共設(shè)2 塊調(diào)查樣地，樣地1 位于黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)松樂(lè)公園，黃檗林齡為37年生，伴生樹(shù)種為白樺、榆樹(shù)、紫丁香、榆葉梅，郁閉度為0.6。樣地2 位于東北林業(yè)大學(xué)哈爾濱實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，黃檗林齡為56年生，伴生樹(shù)種為樟子松、蒙古櫟、榆樹(shù)、烏蘇里鼠李、暖木條莢蒾，郁閉度為0.7。在樣地內(nèi)隨機(jī)抽取健康和受害的黃檗雌雄植株各6 株，在每株樣樹(shù)樹(shù)冠的上、中、下3 個(gè)層次的東、南、西、北4 個(gè)方向，即12 個(gè)方位采摘健康葉片，將同株樣樹(shù)上所采摘的葉片充分混合后，裝入夾鏈袋內(nèi)，并迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室放入冰柜中-40 ℃保存待測(cè)。

1.2 酚酸測(cè)定

酚酸提取:參照文獻(xiàn)［14］略做改動(dòng)。取黃檗葉片干樣1 g 立即置于25 mL 三角瓶中，加入1 mol/L NaOH 15 mL，密封，超聲振蕩3 h，過(guò)濾。用1 mol/L HCl 將濾液pH 值調(diào)至2，加NaCl 達(dá)到飽和，用乙醚將其經(jīng)高速冷凍離心機(jī)抽提3 次(0 ℃條件下8 000 r/min 離心6 min，重復(fù)3 次)，合并乙醚相，加無(wú)水硫酸鈉脫水至無(wú)結(jié)晶析出，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)至干，加入2 mL 色譜純甲醇，使其干物質(zhì)完全溶解，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)提取液。

酚酸標(biāo)樣配制:分別稱(chēng)取12 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)樣品各1 mg，用色譜純甲醇定容至10 mL 配成12 種酚酸混合標(biāo)樣母液。

色譜分析條件:參照文獻(xiàn)［15］略做改動(dòng)，采用Waters 高效液相色譜測(cè)定待測(cè)提取液中的酚酸。色譜柱為C18柱，柱溫為室溫，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，自動(dòng)進(jìn)樣，流速0.45 mL/min。流動(dòng)相A 為V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)= 10 ∶88 ∶2;B為V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)= 90 ∶8 ∶2。洗脫程序:0 ～20 min，A 為100%～98%;20 ～55 min，A為98%～50%;55～60 min，A 為50%～100%。

酚酸的定性與定量:根據(jù)酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間及其在254 nm 的紫外吸收光譜對(duì)樣品中的酚酸定性，用Waters 色譜工作站測(cè)定純度后，依據(jù)外標(biāo)曲線計(jì)算酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg·g-1)。每個(gè)樣品測(cè)定重復(fù)3 次。酚酸總量為每個(gè)樣品中所有酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的總和。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理使用SPSS16.0 軟件，采用Univariate模型對(duì)性別、樹(shù)齡、健康狀況和生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行交互效應(yīng)分析(α=0.05 或α=0.01);以O(shè)ne-Way ANOVA(單向方差分析法)和Paired-Sample T Test(配對(duì)樣本t 檢驗(yàn))進(jìn)行差異顯著性分析，以最小差異顯著法LSD 對(duì)性別、樹(shù)齡、健康狀況和生長(zhǎng)時(shí)期的影響進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃檗被害率

由表1可見(jiàn)，黃檗植株被害率在不同生長(zhǎng)時(shí)期受害程度有明顯差異;在6月份被害率最低，在7月份被害率最高，達(dá)96.23%;在8月份被害率較7月份有所下降，但仍然高于6月份。雌雄株之間、株被害率和葉片被害率存在明顯差異，兩個(gè)樣地中不同月份的被害率均是雄株低于雌株，且都是株被害率低于葉片被害率。比較不同樣地雌雄性植株被害率，發(fā)現(xiàn)在性別相同的情況下，樣地1 植株被害率在調(diào)查的3 個(gè)月份中均小于樣地2。

調(diào)查結(jié)果表明，黃檗植株被害率在不同生長(zhǎng)時(shí)期受害程度有明顯差異;且雌雄株之間、株被害率和葉片被害率也有明顯差異。由表1可見(jiàn):在6月份被害率程度最低，在樣地1 和樣地2 中株被害率最低可達(dá)12.97%，葉片被害率最低可達(dá)40.51%。在7月份被害率程度最高，樣地1 和樣地2 中株被害率最高可達(dá)93.62%，葉片被害率最高可達(dá)96.23%。在8月份被害率位于6、7月份中間，樣地1 和樣地2 中株被害率為42.85%～79.31%介于6、7月份之間，葉片被害率為66.67%～88.92%介于6、7月份之間。各個(gè)月份和各個(gè)樣地中的被害率均是雄株低于雌株，且都是株被害率低于葉片被害率，6—8月份樣地1 和樣地2 的株被害率、葉片被害率均是雄株低于雌株，且株被害率低于葉片被害率(見(jiàn)表1)。

2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期黃檗健康和受害植株的葉片內(nèi)酚酸種類(lèi)的差異

在不同生長(zhǎng)時(shí)期黃檗健康和受害植株的葉片內(nèi)檢測(cè)到原兒茶酸、綠原酸，咖啡酸、香豆酸、水楊酸、苯甲酸、苯乙酸、阿魏酸和肉桂酸9 種酚酸(見(jiàn)表2)。從表2中可看出，6月份，健康和受害植株的葉片內(nèi)都檢測(cè)到香豆酸和肉桂酸。56年生的健康雄株的酚酸種類(lèi)最少，僅檢測(cè)到3 種酚酸;7月份，健康和受害植株的葉片內(nèi)均檢測(cè)到綠原酸、香豆酸、苯甲酸、苯乙酸和肉桂酸。37年生的受害雌株的酚酸種類(lèi)最多，檢測(cè)到9 種;8月份，健康和受害植株的葉片內(nèi)共同檢測(cè)到香豆酸、苯甲酸、苯乙酸和肉桂酸。3 個(gè)月份中，受害植株的酚酸種類(lèi)均多于健康植株，如原兒茶酸、水楊酸或阿魏酸多出現(xiàn)在受害植株中。在檢測(cè)到的酚酸中原兒茶酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)期黃檗健康和受害植株的葉片內(nèi)酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及種類(lèi) mg·g-1

2.3 黃檗性別、樹(shù)齡、健康狀況和生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)葉片內(nèi)酚酸總量的影響

從表3中可看出，性別對(duì)葉片內(nèi)酚酸總量的影響差異顯著(P＜0.05)，而樹(shù)齡、健康狀況及生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)葉片內(nèi)酚酸總量的影響差異均極顯著(P＜0.01)。

表3 影響黃檗葉片內(nèi)酚酸總量的四因素方差分析

2.4 不同生長(zhǎng)時(shí)期黃檗健康和受害植株的葉片內(nèi)酚酸總量的時(shí)序變化

從表4中可看出，不同樹(shù)齡的健康和受害雌雄株葉片內(nèi)酚酸總量，從大到小依次為7月份、8月份、6月 份，且7月 份 均 與6月 和8月 差 異 極 顯 著(P＜0.01)，健康和受害植株酚酸總量之間的差異均顯著(P＜0.05)。3 個(gè)月份中，不同樹(shù)齡的健康和受害雌株的酚酸總量均極顯著高于雄株的(P＜0.01)，且不同樹(shù)齡之間酚酸總量的差異也均極顯著(P＜0.01)。

表4 不同生長(zhǎng)時(shí)期黃檗健康和受害植株葉片內(nèi)酚酸總量的時(shí)序變化 mg·g-1

3 結(jié)論與討論

植物和昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中不斷相互作用，形成了各種防御及適應(yīng)機(jī)制。植物體內(nèi)酚酸含量的變化是其適應(yīng)昆蟲(chóng)作用產(chǎn)生的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝相互協(xié)調(diào)的結(jié)果［16］。植物體內(nèi)酚酸的積累與其抗性有關(guān)［17-18］。本研究結(jié)果表明，在6、7、8月份中，健康和受害的黃檗葉片內(nèi)酚酸總量，從大到小依次為7月份、8月份、6月份，這一變化趨勢(shì)與其害蟲(chóng)黃波欏麗木虱的種群數(shù)量變化趨勢(shì)相吻合。說(shuō)明黃檗在長(zhǎng)期與黃波欏麗木虱的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的隨時(shí)序調(diào)整抗蟲(chóng)性的機(jī)制。比較分析健康與受害黃檗葉片酚酸種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)受害黃檗葉片酚酸種類(lèi)較多。7月份，總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，37年生受害植株葉片檢測(cè)到咖啡酸、香豆酸、水楊酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于健康植株，并新增加了原兒茶酸;綠原酸、苯甲酸、苯乙酸、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，由此推測(cè)黃檗是通過(guò)改變自身各酚酸組份及含量來(lái)防御麗木虱的危害。

植物對(duì)昆蟲(chóng)的防御是通過(guò)害蟲(chóng)脅迫引起植物生理的應(yīng)激反應(yīng)，即植物體內(nèi)產(chǎn)生不同保護(hù)防御性物質(zhì)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。37年生的黃檗雌雄葉片內(nèi)總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于56年生，前者受害蟲(chóng)危害率明顯低于后者;56年生受害葉片的多種酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于健康葉片，而37年生受害葉片的多種酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于健康葉片，表現(xiàn)出更強(qiáng)的可誘導(dǎo)性。說(shuō)明黃檗在不同林齡等級(jí)其自身的抗性應(yīng)激能力發(fā)生了變化。Wang 等［19］對(duì)剪葉及蟲(chóng)害處理的興安落葉松防御酶的研究也表明，興安落葉松的幼嫩組織在損傷處理后能夠表現(xiàn)出更強(qiáng)的可誘導(dǎo)性，而衰老組織相對(duì)較弱。

黃檗為雌雄異株［20］，雌株葉片內(nèi)酚酸總量顯著高于雄株，且受害后雌株葉片內(nèi)多種酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著高于雄株，這與二者的生理特點(diǎn)有關(guān)。雌株具有結(jié)實(shí)的生理特性，其在結(jié)實(shí)過(guò)程中需要吸收大量的養(yǎng)分，其本身的生理代謝機(jī)能較雄株更為旺盛，儲(chǔ)備的能量源也更為豐富［21］。在防御外界危害時(shí)，植物儲(chǔ)備的能量源，將一部分分配于其防御系統(tǒng)，以抵御危害，其代價(jià)往往是生長(zhǎng)速率［22］的降低。相對(duì)雄株而言，雌株在遭遇害蟲(chóng)危害時(shí)可用于防御的能量源相對(duì)較多，因此表現(xiàn)其防御物質(zhì)的可誘導(dǎo)性也相對(duì)較強(qiáng)。

由此可見(jiàn)，黃檗酚酸的種類(lèi)和含量在不同性別、樹(shù)齡以及不同健康狀況的植株上的表現(xiàn)有所不同，說(shuō)明其抗性強(qiáng)弱與這3 個(gè)因素非常密切，因此可以根據(jù)這一變化規(guī)律對(duì)抗性較弱的黃檗，采取適當(dāng)?shù)墓芾泶胧┚S護(hù)林木的正常生長(zhǎng)，達(dá)到防蟲(chóng)抗蟲(chóng)的目的。

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