張龍飛，崔玉娟，平 政，曹雪濱

運動是一種特殊的生理、病理過程，適量的運動有助于維持人體的健康以及提升運動能力，但過度的力竭運動則導致機體損傷，特別是力竭性心臟損傷［1］。力竭運動導致的心肌損傷臨床較多見，表現(xiàn)為各種形式，包括心臟性猝死、嚴重心律失常、心力衰竭等。線粒體是真核細胞的主要供能細胞器，是細胞發(fā)生呼吸作用的主要場所，通過電子傳遞呼吸鏈的氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生三磷腺苷(ATP)，供細胞利用。線粒體呼吸功能下降會導致能量代謝障礙，影響正常生理功能。目前的研究發(fā)現(xiàn)運動及耐力訓練與線粒體的功能之間有密切關(guān)系［2-4］?？疾炀€粒體呼吸鏈復合物的功能普遍采用將線粒體分離后測定單個線粒體復合物活性的方法，但氧化磷酸化必須在完整的線粒體中進行，因此分離線粒體的方法不能揭示復合物如何相互作用。本課題提供一種原位分析線粒體功能的方案，可保留在細胞內(nèi)原位置和裝配條件下的線粒體功能的特征及與其他細胞器的交互作用。紅景天苷(Salidroside，SAL)是從植物紅景天中提取的一種有效成分，具有抗心肌缺血、保護缺血再灌注損傷、抗缺氧等作用，通過增加肝糖原含量，提高紅細胞和肝臟的過氧化物歧化酶活性，降低血漿、心肌、腦的過氧化脂質(zhì)含量等途徑，有效提高機體耐缺氧能力和抗疲勞能力［5-6］。本研究擬通過研究力竭運動及紅景天苷對大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體呼吸功能的影響，探討紅景天苷對大鼠心肌的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 清潔級雄性SD大鼠［軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(京)2003-1-003］，體重(120±20)g。98%紅景天苷粉劑(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，所有用于測定線粒體呼吸功能的試劑均購自美國Sigma公司，高分辨率線粒體呼吸儀 Oxygraph-2k(奧地利Oroboros)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥:將40只雄性SD大鼠隨機分為對照(C)組、力竭(EE)組、低劑量SAL(LS)組、高劑量SAL(HS)組，每組10只。將SAL粉劑用0.9%氯化鈉注射液分別配制成濃度為0.1 g/L及0.3 g/L的 SAL溶液，LS組與 HS組分別給予 100、300 mg/(kg·d)灌胃2周，C組與EE組給予生理鹽水10 ml/(kg·d)灌胃2周。

1.2.2 模型制備及取材:采用經(jīng)典的Thomas方法［7］制備力竭心臟損傷模型。大鼠游泳采用清潔的塑料圓桶(高55 cm，直徑50 cm)，水溫(32.0±0.5)℃，水深50 cm。正式實驗時，除C組外，其他各組均參加一次力竭性訓練。力竭標準參考Thomas力竭標準［7］:①大鼠沉入水下無法返回水面超過10 s;②大鼠協(xié)調(diào)運動消失，在水中無方向性地亂竄，雖未達到10 s亦定為力竭。如果大鼠在短時間內(nèi)就達到力竭狀態(tài)，將其撈出后休息5 min，再繼續(xù)游泳運動，保證大鼠的游泳時間在2 h以上。在大鼠游泳過程中觀察其游泳狀態(tài)，防止因嗆水而導致的意外死亡。

1.3 觀察指標

1.3.1 光鏡及電鏡觀察大鼠心室肌組織:EE、LS、HS組于力竭游泳運動后即刻取材，C組同時在安靜狀態(tài)下取材。取大鼠心尖部心室肌組織，用10%甲醛固定，制做5μm連續(xù)切片，HE常規(guī)染色，光鏡下觀察及照相。另取同一部位心肌組織用4%戊二醛溶液固定，磷酸緩沖液沖洗，再用1%四氧化鋨后固定，梯度丙酮脫水后用包埋劑浸透，用超薄切片機將樣品切成厚約50 nm的超薄切片，然后用醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛電子染色，最后使用投射電鏡進行觀察及照相。

1.3.2 線粒體呼吸功能測定:①大鼠心肌的分離及透化。使用眼科剪及鑷子將心肌沿心肌纖維走行分離成束，每個束包含6～8個肌纖維(稱濕重5～7 mg)，盡量將肌纖維束相互分離。稱取5 mg Saponin加入到1 ml BIOPS分離介質(zhì)中配制成Saponin母液，然后取21μl Saponin母液加入到2 ml BIOPS分離介質(zhì)中配制成Saponin透化溶液［8］。將分離好的肌纖維放入saponin透化液中。輕微震蕩30 min使肌纖維充分透化，將透化好的肌纖維轉(zhuǎn)移到裝有MIR06呼吸介質(zhì)的試管中，輕微震蕩5 min，重復3次以洗脫透化液。②高分辨率線粒體呼吸儀測定線粒體呼吸功能［9-11］。在Oxygraph-2k高分辨率線粒體呼吸儀反應(yīng)倉中加入呼吸介質(zhì)MIR06 2 ml，將透化好的肌纖維放入反應(yīng)倉內(nèi)，加入蘋果酸(Malate，Mal)10 μl以及谷氨酸鈉(Glutamate，Glu)12.5 μl，待呼吸速率平穩(wěn)后再加入二磷腺苷(ADP)10μl，可得到復合物Ⅰ的態(tài)3呼吸速率。加入底物琥珀酸(Succinate，Suc)20μl激活線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ，待呼吸速率平穩(wěn)后加入復合物Ⅰ的特異抑制劑魚藤酮(Rotenone，Rot)10μl，抑制了線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活性，得到復合物Ⅱ的呼吸速率。加入線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ的特別抑制劑抗霉素A，待呼吸速率平穩(wěn)后加入5μl TMPD和5μl抗壞血酸鹽激活線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ，得到復合物Ⅳ的呼吸速率。

1.4 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。各組符合正態(tài)、方差齊性(α＞0.1)，采用單因素方差分析，方差不齊時采用Dunnertt法，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu) C組:心肌結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列整齊，間質(zhì)無水腫，肌膜無破損，無肌纖維斷裂、變性、壞死;EE組:可見肌纖維斷裂、排列紊亂，間質(zhì)纖維增生、水腫，心肌細胞腫脹明顯，大量炎細胞浸潤;LS組、HS組:偶見肌纖維斷裂，間質(zhì)水腫較輕，可見變性病變，少量炎細胞浸潤，HS組大鼠心肌纖維的完整性要好于LS組，整體形態(tài)更接近C組。見圖1。

圖1 4組大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu)(HE×400)A.對照組;B.力竭組;C.低劑量紅景天苷組;D.高劑量紅景天苷組

2.2 大鼠心肌超微結(jié)構(gòu) C組:可見完整的細胞核、線粒體，線粒體數(shù)量和形態(tài)正常，核仁明顯、肌節(jié)清晰;線粒體完整無損，無腫脹、融合、變形等。EE組:線粒體體積增大，可見畸形的線粒體，核端基質(zhì)內(nèi)線粒體部分嵴和少部分膜融合、模糊不清并且嵴有斷裂。LS組:線粒體周邊水腫，膜嵴融合，局部缺損。HS組:線粒體個別輕度融合，核周隙輕度擴張，偶見線粒體膜破損。見圖2。

圖2 4組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)(×12 000)A.對照組;B.力竭組;C.低劑量紅景天苷組;D.高劑量紅景天苷組

2.3 心肌線粒體呼吸功能測定結(jié)果

2.3.1 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的態(tài)3呼吸速率比較:與C組相比，EE組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的態(tài)3呼吸速率明顯降低，而LS、HS組明顯高于EE組，其中HS組又明顯高于LS組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.3.2 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ的態(tài)3呼吸速率比較:與C組相比，EE組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ的態(tài)3呼吸速率明顯降低(P＜0.05)，而 HS組明顯高于 EE組以及 LS組(P＜0.05)，LS組與 EE組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.3.3 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ的態(tài)3呼吸速率比較:與C組相比，EE組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ的態(tài)3呼吸速率明顯降低，HS組明顯高于LS組與EE組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而LS組與EE組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 4組大鼠心肌線粒體呼吸功能比較［x ± s，pmol/(s·mg)］

3 討論

3.1 紅景天苷對力竭大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響有研究表明力竭運動會對心肌的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［12］，國內(nèi)也有研究證實，大強度運動時骨骼肌線粒體腫脹，個別膨大成絮狀，而超大強度運動會導致線粒體體積顯著增大，體表面積與體積的比值降低，嵴斷裂，基質(zhì)密度普遍降低，甚至會出現(xiàn)空泡等退行性變化［13-14］。

本研究在觀察大鼠的顯微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，EE組大鼠心肌結(jié)構(gòu)遭到破壞，心肌細胞腫脹明顯，大量肌纖維發(fā)生斷裂、排列紊亂，細胞間質(zhì)纖維增生、水腫，大量炎細胞浸潤。其超微結(jié)構(gòu)同樣變化明顯，大鼠心肌核周基質(zhì)高度水腫，核周隙變寬，并且可以發(fā)現(xiàn)腫脹變大的線粒體，核端基質(zhì)內(nèi)線粒體部分嵴和少部分膜融合、模糊不清或缺失，少量肌纖維壞死。而SAL組大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu)相對于EE組明顯好轉(zhuǎn)，偶見肌纖維斷裂，間質(zhì)水腫較輕，可見變性病變，少量炎細胞浸潤。此外，LS組超微結(jié)構(gòu)示，線粒體周邊水腫，膜嵴融合，局部缺損。HS組超微結(jié)構(gòu)示，線粒體個別輕度融合，核周隙輕度擴張，偶見線粒體膜破損?？傮w觀察HS組相對于LS組線粒體變異程度較輕，線粒體膜結(jié)構(gòu)相對完整。

3.2 紅景天苷對力竭大鼠心肌線粒體呼吸功能的影響 人類的心臟每天要消耗大概30 kg ATP以支持收縮活動［15］，其中 90% 來源于線粒體［16］。線粒體是真核細胞的主要供能細胞器，是細胞發(fā)生呼吸和氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的主要場所。線粒體的基本功能就是轉(zhuǎn)換底物的氧化還原勢能為質(zhì)子電化學勢能，質(zhì)子電化學勢能再轉(zhuǎn)化為ATP的高能磷酸鍵［17］。線粒體中物質(zhì)脫下的氫，經(jīng)一系列酶及其輔酶輔基連續(xù)的傳遞作用，最后與激活的氧化合成水并釋放能量的過程與細胞攝取氧的呼吸過程有關(guān)，故稱電子傳遞呼吸鏈。電子傳遞鏈參與將食物轉(zhuǎn)化成化學能的過程，將能量以ATP的形式儲存供細胞利用。線粒體呼吸鏈的電子傳遞是由5個酶呼吸鏈復合物(呼吸鏈復合物Ⅰ～Ⅴ)構(gòu)成，其中呼吸鏈復合物Ⅰ(NADH-CoQ還原酶)、呼吸鏈復合物Ⅱ(琥珀酸-CoQ還原酶)、呼吸鏈復合物Ⅲ(CoQ-細胞色素C還原酶)及呼吸鏈復合物Ⅳ(細胞色素氧化酶)是構(gòu)成酶呼吸鏈復合物的重要組成部分，其活性變化能直接或間接地反映線粒體的功能變化，線粒體不能充足地供應(yīng)ATP就會導致能量衰竭［18］。

既往對線粒體功能的分析多采用體外分離法［19-20］，即通過離心的方法將線粒體從組織中提取出來，然后通過Clark氧極法［21］來測定線粒體的呼吸功能。雖然該方法也能夠通過測定線粒體不同呼吸狀態(tài)時的耗氧量反映其氧化磷酸化能力，但是體外提取法有如下弊端:①線粒體性質(zhì)容易受到分離步驟的影響，尤其是從病理損傷組織中提取的線粒體，這種影響體現(xiàn)得更加顯著［22］。②需要大量的細胞(200×106)或組織(濕重500 mg以上)，以分離出高質(zhì)量的線粒體。③一些提取方法可能會導致對某一種線粒體族群的特別選擇。腫脹的線粒體密度會降低，因此離心提取線粒體時可能會導致對完整細胞器的優(yōu)先選擇，從而使得病理的細胞器所占比例下降。④分離提取線粒體會破壞正常的線粒體間的相互作用。大量的研究證明，正常線粒體間的相互作用對于代謝通道、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換等至關(guān)重要［23］。本實驗采用原位法測定線粒體的功能，即通過透化細胞膜而不破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，使得各種底物可以直接參與線粒體的呼吸過程。應(yīng)用原位法不僅可以避免體外分離法的弊端，同時可以實現(xiàn)在完整細胞系統(tǒng)中、正常的細胞器位置和裝配下，保留與細胞骨架、細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用，完成對線粒體的分析。因此，原位分析法比體外分離法更能接近正常細胞的生理狀態(tài)。

既往有研究指出，在動物心臟中，線粒體的缺陷將導致線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ～Ⅳ以及ATP合成酶活性的降低［24-26］。本研究發(fā)現(xiàn)EE組大鼠線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的態(tài)3呼吸速率明顯低于C組，說明力竭大鼠的線粒體呼吸鏈復合物的活性降低，線粒體的呼吸功能下降。其可能的機制有氧化應(yīng)激［27-28］、鈣超載［29］、電子漏引起質(zhì)子漏等假說［30-31］。應(yīng)用SAL后，大鼠心肌線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的態(tài)3呼吸速率明顯升高，說明此時線粒體呼吸鏈復合物的活性增加。在ADP充足的態(tài)3呼吸時，通過線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化反應(yīng)，ATP大量生成以供細胞利用，并維持細胞的正常生理功能，從而實現(xiàn)了SAL對大鼠心肌的保護作用。其中，HS組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的態(tài)3呼吸速率均明顯高于LS組，則說明SAL對大鼠心肌的保護作用呈劑量依賴性。

綜上所述，SAL能夠預防力竭運動對大鼠心肌結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的損傷，提高心肌線粒體的呼吸功能，從而發(fā)揮對心肌的保護作用，并且高劑量SAL的效果要優(yōu)于低劑量，但SAL更深層次的心肌保護機制還有待于進一步研究。

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