段朝霞，張潔元，陳魁君，李曉霞，王建民，李兵倉

多巴胺D2受體(DRD2)是多巴胺受體之一，屬于G蛋白偶聯(lián)家族，能通過與 Gi/Go偶聯(lián)抑制cAMP的形成，在體內(nèi)發(fā)揮重要作用。DRD2主要分布于紋狀體內(nèi)，參與認(rèn)知、情緒、運動及內(nèi)分泌等多種功能活動的調(diào)節(jié)［1］。人類DRD2基因位于第11號染色體，全長270 kb，共有8個外顯子。大量研究證實，DRD2基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)、抑郁癥、精神分裂癥、藥物及酒精成癮等精神類疾病發(fā)生的易患性及藥物治療的敏感性相關(guān)［2-5］。本課題組前期的研究通過HapMap檢索發(fā)現(xiàn)DRD2基因第3內(nèi)含子區(qū)51 103 bp位點的rs2075652多態(tài)性可能與PTSD的易患性相關(guān)，然而截至目前該位點的具體生物學(xué)機制還不十分清楚。鑒于此，本研究擬構(gòu)建含單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs2075652位點的DRD2基因熒光素酶表達載體，為今后探索其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pmirGlo質(zhì)粒、海腎熒光素酶表達質(zhì)粒pRL-SV40、DNA純化試劑盒和雙熒光素酶報道基因試劑盒均為Promega公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司;高保真DNA聚合酶、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶購于Takara公司(大連);限制性內(nèi)切酶Sac I、Xho I購自NEB公司;脂質(zhì)體Lipofectine 2000TM為Invitrogen公司產(chǎn)品;DMEM、胎牛血清購自Gibco;人胚腎癌細胞株HEK293購自中國科學(xué)院細胞庫，為本研究組保存，培養(yǎng)于含有 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中;感受態(tài)細胞E.coli DH5α和培養(yǎng)基等其他試劑均由南方中心實驗室提供;PCR引物由上海生物工程有限公司合成;PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒測序均由Takara公司(大連)完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 含rs2075652多態(tài)位點的第3內(nèi)含子區(qū)序列擴增及純化:按照北京天根生物技術(shù)有限公司試劑盒說明書提取人全血基因組DNA，經(jīng)核酸定量儀定量后置于-70℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)DRD2基因組序列NC-000011.9 Reference GRCh37.p5 Primary Assembly(GenBank，上下游各延伸 10 kb的序列范圍:113270317～113356001)，設(shè)計4條擴增DRD2第3內(nèi)含子區(qū)序列及51 103 bp位點突變的引物。rs2075652-1:5＇ ctgcactggacactggggactctag 3＇，rs2075652-2:5＇cttggggatccttgccggttact 3＇;rs2075652-M1:5＇atcccaactaccatttgtaaagtgcttac 3＇;rs2075652-M2:5＇gtaagcactttacaaatggtagttgggat 3＇。以人全血基因組DNA為模板，先用rs2075652-1與rs2075652-2擴增啟動子區(qū)序列，并克隆至PTA2載體中，測序鑒定正確后，再雙酶切(Sac I+Xho I)，然后亞克隆至pmir-Glo載體。含突變位點的序列則以PTA2-652質(zhì)粒為模板，以引物rs2075652-1和rs2075652-M1、引物rs2075652-2和rs2075652-M2分別進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)后，再以兩段 PCR產(chǎn)物為模板，以rs2075652-1和rs2075652-2為引物，進行融合PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)均采用25μl反應(yīng)體系進行PCR擴增，循環(huán)參數(shù)為:98℃ 5 min，98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，35 個循環(huán)，72℃ 10 min。取 5 μl PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.2.2 熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定:膠回收的PCR產(chǎn)物與經(jīng)過改造的報告基因載體pmirGlo均以Sac I和Xho I雙酶切，對目的條帶采用膠回收并進行純化。純化過的DNA片段和質(zhì)粒按2︰1的比例，在 T4 DNA連接酶作用下連接2 h，得到重組質(zhì)粒pmirGlo-DRD2-T和pmirGlo-DRD2-C。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α細菌，于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基平皿上進行選擇培養(yǎng)。挑取其中3個克隆擴增并經(jīng)Sac I和Xho I雙酶切和測序鑒定。測序工作由Takara公司(大連)完成。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性測定:將處于對數(shù)生長期的HEK293細胞經(jīng)胰酶消化后重懸，細胞密度為1.5×105個/ml，各取200 ml/孔接種于48孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。細胞匯合度為80%左右時，將重組質(zhì)粒pmirGlo-DRD2-T和pmirGlo-DRD2-C轉(zhuǎn)染細胞，為校正孔間轉(zhuǎn)染效率，各組均用表達海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒pRLSV40同時進行轉(zhuǎn)染，每個樣品設(shè)3個重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法:首先形成Lipofectine-DNA復(fù)合物，室溫靜置20 min后，將Lipofectine-DNA復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后更換成含10%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，檢測熒光強度，實驗結(jié)果取各次平均值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因監(jiān)測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性:取細胞裂解液20μl，在其中加入100μl的Firefly luciferase檢測試劑，混勻后立即在化學(xué)發(fā)光儀中檢測發(fā)光值，記錄10 s時的值(對應(yīng)于Firefly的表達水平);然后再加入100μl的stop＆Glo試劑，同樣檢測10 s時的化學(xué)發(fā)光值(對應(yīng)于Renilla熒光素酶的表達水平)，以二者比值(F/R)為校正后的結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 含rs2075652多態(tài)位點的第3內(nèi)含子區(qū)序列PCR擴增 將PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下可見1條明顯的DNA條帶位于399 bp附近，與所需擴增片段大小相符，且無非特異性擴增片段，此條帶即為設(shè)計擴增含rs2075652位點T的目的片段(見圖1A)。將目的片段克隆至PTA2載體中，進行測序鑒定。再以PTA2-652質(zhì)粒為模板，以引物rs2075652-1和rs2075652-M1、引物rs2075652-2和rs2075652-M2分別進行PCR擴增，分別擴出278 bp和189 bp的目的條帶(見圖1B);再以兩段 PCR產(chǎn)物為模板，以 rs2075652-1和rs2075652-2為引物，進行融合 PCR反應(yīng)，擴增出399 bp的含rs2075652突變位點C的目的條帶(見圖1C)。

圖1 含rs2075652-多態(tài)位點的第3內(nèi)含子區(qū)序列PCR擴增產(chǎn)物A.用rs2075652-1和rs2075652-2引物、人基因組DNA為模板擴增的PCR產(chǎn)物;M.DL2000 DNA Marker，1.擴增的PCR產(chǎn)物。B.用rs2075652-1、rs2075652-M1和 rs2075652-M2、rs2075652-2兩對引物分別擴增的 PCR產(chǎn)物;M.DL2000 DNA Marker，1.rs2075652-1、rs2075652-M1擴增的PCR產(chǎn)物，2.rs2075652-M2、rs2075652-2擴增的PCR產(chǎn)物。C.用rs2075652-1和rs2075652-2為引物、B的兩種PCR產(chǎn)物為模板擴增的融合PCR產(chǎn)物;M.DL2000 DNA Marker;1.融合擴增的PCR產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌克隆、培養(yǎng)，隨機挑取3個單菌落中的少許菌體為模板進行擴增并經(jīng)Sac I和Xho I雙酶切鑒定結(jié)果見圖2，得到大小為7 kb左右的pmirGlo質(zhì)粒片段和含rs2075652 T和rs2075652 C的第3內(nèi)含子區(qū)的目的條帶。1號克隆送公司進行測序分析，其測序結(jié)果與GenBank中的DRD2基因啟動子序列比對后完全一致，證實重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，測序結(jié)果(常見多態(tài)位點為反向測序，突變位點為正向測序)見圖3。

圖2 多巴胺D2受體-T和多巴胺D2受體-C重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定M.DL15000 DNA Marker;1.pmirGlo-DRD2-T質(zhì)粒雙酶切;2.pmirGlo-DRD2-C質(zhì)粒雙酶切

2.3 熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)錄活性 轉(zhuǎn)染pmirGlo-DRD2-C質(zhì)粒的細胞裂解液中熒光素酶活性(0.542±0.004)強于轉(zhuǎn)染pmirGlo-DRD2-T質(zhì)粒的細胞裂解液(0.474±0.016)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)，見圖4。

3 討論

DRD2是最受關(guān)注、也是研究最多的多巴胺受體之一。既往研究顯示，DRD2是與PTSD關(guān)系最為密切的多巴胺受體，因為大多數(shù)經(jīng)典的抗精神病藥物的藥理學(xué)作用中都有拮抗DRD2的作用，且藥物效價與拮抗強度有關(guān)。動物實驗證實邊緣系統(tǒng)中杏仁核等區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元對創(chuàng)傷應(yīng)激高度敏感［6］。在中樞應(yīng)用DRD2激動劑阿撲嗎啡可以降低白鼠實驗性創(chuàng)傷應(yīng)激后的死亡率，而多巴胺受體阻滯劑舒必利則有相反的效果，而PTSD患者的尿中多巴胺及其代謝產(chǎn)物高香草醛酸濃度增高，其水平與癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)［7］。PTSD患者中樞神經(jīng)多巴胺系統(tǒng)可能存在缺陷，而無法適宜地應(yīng)對創(chuàng)傷應(yīng)激，導(dǎo)致暫時或持續(xù)性的精神異常癥狀。因此，DRD2基因改變可能是導(dǎo)致各種精神異常行為、精神及神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因［8-10］。

自被發(fā)現(xiàn)以來，內(nèi)含子一直是人們爭論的焦點。因內(nèi)含子屬于非編碼序列，曾一度被認(rèn)為其存在沒有任何意義，是無用基因，因此目前對內(nèi)含子的功能還知之甚少。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子并不是基因組的“垃圾”，而是在基因表達調(diào)控中有重要的生物學(xué)功能。另外，在原核生物基因中不存在內(nèi)含子或含有少量的內(nèi)含子，而在真核生物基因中內(nèi)含子的存在是普遍現(xiàn)象，內(nèi)含子的長度遠遠大于外顯子，甚至在人類基因組中非編碼序列占到95% ～97%［11］。由此可見，生物進化程度越高，其內(nèi)含子所含比例也越高，這也進一步說明內(nèi)含子是具有重要生物學(xué)功能的。對于內(nèi)含子的功能，目前普遍認(rèn)為它們與基因的表達調(diào)控有關(guān)，如內(nèi)含子含有增強子或其他順式作用元件，促進轉(zhuǎn)錄的起始或延伸，增加了mRNA在核內(nèi)的穩(wěn)定性，可充當(dāng)啟動子等。因含有增強啟動子的序列，在一些基因中，內(nèi)含子可增強基因轉(zhuǎn)錄的起始反應(yīng)。內(nèi)含子由于含有增強子的組分，或由于拼接體及多聚腺昔酸化作用保護mRNA前體，使其免受RNA酶的作用，增強了基因的表達。在另一些基因中，內(nèi)含子可抑制轉(zhuǎn)錄的延長，轉(zhuǎn)錄衰減位點可能位于內(nèi)含子上，從而導(dǎo)致基因的失活［12］。

報告基因是一種編碼可供檢測的酶或蛋白質(zhì)的基因，是基因表達調(diào)控研究的一個重要工具，通過測定報告基因的表達產(chǎn)物，可以推測出該DNA片段在基因表達調(diào)控中的作用［13］。本研究采用高保真PCR法從人全血基因組中擴增出了DRD2基因第3內(nèi)含子區(qū)399 bp的含rs2075652多態(tài)位點的序列，并將其分別克隆到pmirGlo-Basic質(zhì)粒的多克隆位點中，成功構(gòu)建了人 pmirGlo-DRD2-T和 pmirGlo-DRD2-C熒光素酶報告基因，并證實了rs2075652多態(tài)位點由T突變?yōu)镃后，熒光素酶活性增強，說明DRD2基因第3內(nèi)含子區(qū)55 103位點可能為轉(zhuǎn)錄增強位點或具有增強子活性，為研究DRD2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)，但其增強轉(zhuǎn)錄活性的具體分子機制還有待于進一步深入研究證實。

圖3 重組質(zhì)粒的pmir Glo-DRD2-T和pmir Glo-DRD2-C的測序結(jié)果

圖4 重組質(zhì)粒pmir Glo-DRD2-T和pmir Glo-DRD2-C熒光素酶活性比較結(jié)果b P＜0.01

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