楊 軍，孔祥瑞，王讓劍，鄭國華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

金牡丹自然雜交后代遺傳差異分析

楊 軍，孔祥瑞，王讓劍，鄭國華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

利用EST-SSR對茶樹品種鐵觀音、黃棪、金牡丹及其自然雜交后代，進行初步遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。14對EST-SSR標(biāo)記共檢測到等位位點62個，平均檢測到4.43個，Shannon信息指數(shù)1.22，Simpson指數(shù)0.70。在相似系數(shù)0.73時，金牡丹自然雜交后代可分為4組。結(jié)果表明，第I組與鐵觀音親緣關(guān)系最近，第II組與金牡丹親緣關(guān)系最近，第II組組內(nèi)遺傳多樣性較高；4個組間在樹幅、葉片長、葉片寬等性狀上達到顯著性差異，每組在性狀上都具有一定的群體特征。

茶樹；自然雜交；EST-SSR；親緣關(guān)系；遺傳多樣性

EST-SSR是基于EST序列或cDNA數(shù)據(jù)開發(fā)的一種分子標(biāo)記，來自于功能基因，具有多態(tài)性高、共顯性、技術(shù)簡單、重復(fù)性好等特點，在遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析、關(guān)聯(lián)分析、種質(zhì)資源鑒定篩選中廣泛應(yīng)用[1-6]。同時茶樹上也應(yīng)用EST-SSR分子標(biāo)記對野生群體資源、自然雜交后代、地方群體種進行群體結(jié)構(gòu)分析。其中，周萌[7]等用27對EST-SSR引物對100份茶樹野生資源和22份栽培品種進行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，認(rèn)為云南野生茶樹的遺傳多樣性豐富。余繼忠[8]等利用EST-SSR標(biāo)記對以福鼎大白茶、云南大葉茶品種為親本選育的40個品種（系）與衍生品種（系）的親緣關(guān)系及遺傳背景進行了分析評估，發(fā)現(xiàn)以云南大葉茶為母本的品種遺傳多樣性比福鼎大白茶為母本的更高。王麗鴛[9]等利用48對SSR引物對來自龍井群體種的5個不同居群的91份材料進行了遺傳多樣性和遺傳分化研究，研究認(rèn)為龍井群體的遺傳分化程度較低，個體間遺傳分化系數(shù)FIT為0.0502，群體之間的遺傳分化系數(shù)FST僅為0.0345。

金牡丹是以鐵觀音為母本（♀），黃棪為父本（♂），采用雜交育種法育成。2003年通過省級品種審定，2010年通過國家級品種鑒定，歷經(jīng)30多年的試驗研究與示范應(yīng)用。金牡丹品質(zhì)優(yōu)異，適制性廣，雜種優(yōu)勢強，綜合性狀優(yōu)異，香氣特高、適制性特廣、制優(yōu)率特高，在省內(nèi)外推廣應(yīng)用中深受生產(chǎn)者、消費者的喜愛[10]。本實驗通過基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合幼齡期性狀調(diào)查，初步分析金牡丹自然雜交后代與金牡丹、鐵觀音、黃棪的遺傳差異。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料為鐵觀音、黃棪、金牡丹和38個金牡丹的自然雜交后代，均種植于福安社口鎮(zhèn)試驗地，采集各個品種（品系）一芽二葉鮮葉，后用液氮迅速冷凍處理，保存在－70℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用改進的CTAB法[11]提取茶樹基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行茶樹基因組分子量大小檢測，用756-MC型紫外分光光度計測定茶樹基因組DNA的純度（OD260/280比值）。

1.2.2 引物合成

參照文獻[12-13]引物序列，序列由上海Sangon公司合成。

1.2.3 PCR擴增和產(chǎn)物鑒定

EST-SSR方法

PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL（Mg2+），dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，上、下游primer（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL（0.5 U），模板DNA1 μL。PCR反應(yīng)于美國ABI-9600型擴增儀上進行，熱循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性4 min，使模板DNA充分變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性45 s，不同溫度條件退火60 s，72oC延伸75 s，重復(fù)35個熱循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

擴增產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠檢測，電泳在JY-SCZ7型電泳儀（北京六一儀器廠）上進行，時間為180 min，電壓設(shè)定為120V，電泳后參照Charters和Wilkinson[12]的方法銀染顯色。Tanon2500R凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）拍照記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Sangon公司的MarkerDL2000作為分子量標(biāo)記，對每一個擴增出的條帶記為“1”，而無條帶或不清晰的記錄為“0”。所得數(shù)據(jù)輸入Excel建立原始表征數(shù)據(jù)矩陣，進一步分析。運用PopGen3.2軟件計算Shannon信息指數(shù)（I）和Nei's基因多樣性指數(shù)（H）。運用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA純度情況

DNA OD260/280比值1.6～1.9，平均值為1.75，DNA純度較好；并從圖1可以看出41份材料都能擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶，說明提取的DNA相對較為穩(wěn)定，且引物的多態(tài)性好。

2.2 不同引物等位位點及多態(tài)性分析

從表1中看出，14對EST-SSR標(biāo)記在參試材料中共檢測到等位位點62個，平均每對引物檢測到4.43個，其中最多的（引物w05、w09）為7個，多態(tài)性十分豐富；14對引物的PIC值范圍從0.37～0.81，平均值為0.61，所有挑選出來的引物的PIC值都高于0.5；14對引物Shannon信息指數(shù)的平均值為1.22，Simpson指數(shù)的平均值為0.70。說明14對引物都含有較高的多態(tài)信息量，具有很好的品種鑒定能力。

圖1 41份茶樹材料的PCR擴增顯示出的多態(tài)性Fig. 1 Polymorphisms of 41 tea varieties by PCR amplification

表1 參試材料的擴增結(jié)果Table 1 Amplification information of tested materials

2.3 親緣關(guān)系分析

在相似系數(shù)0.73處，38個自然雜交后代可被分為4組，第I組為鐵觀音與金牡丹自然雜交后代11個，與鐵觀音最相似；第II組為金牡丹與金牡丹自然雜交后代14個，與金牡丹最相似；第III組為金牡丹自然雜交后代7個，與金牡丹較相似；第IV組為黃棪與金牡丹自然雜交后代6個（見圖1）。

由表2可見，38個金牡丹自然雜交后代與金牡丹的相似系數(shù)均值最高，為0.737，可以初步認(rèn)定自然雜交后代與金牡丹親緣關(guān)系最近，其次是鐵觀音、黃棪。不同的組自然雜交后代與鐵觀音、金牡丹、黃棪的親緣關(guān)系有所差別，第I組與鐵觀音相似系數(shù)平均值為0.803，且多重比較結(jié)果表明，第I組與其它組達到顯著性差異，最相似于鐵觀音；第II組自然雜交后代與鐵觀音、金牡丹、黃棪的相似系數(shù)分別為0.702、0.806、0.693，與金牡丹的相似系數(shù)最高，且多重比較結(jié)果表明，與第I組達到顯著性差異，與金牡丹最相似；第III、IV組分別與金牡丹的相似系數(shù)分別為0.760、0.725，高于鐵觀音、黃棪的相似系數(shù)，說明與金牡丹相似。

2.4 組內(nèi)遺傳多樣性比較

第II組、第IV組的Nei’s基因多樣性相對較高，分別為0.2348、0.2492，同時Shannon信息多樣性指數(shù)，分別為0.3480與0.3701，說明第II組、第IV組組內(nèi)遺傳多樣性比第I組、第III組遺傳多樣性豐富；其中第III組的Nei’s基因多樣性指數(shù)與Shannon信息多樣性指數(shù)，分別為0.1890、0.2776，在4組中屬最低，說明第III組組內(nèi)遺傳多樣性較低（見表3）。

2.5 組幼齡期性狀分析

經(jīng)方差分析，4組間的樹幅（F=3.2*）、葉長（F=12.59**）、葉寬（F=3.63*）、長寬比（F=2.85*）達到顯著性差異。從表4多重比較結(jié)果看出，第IV組樹幅、葉寬、長寬比值最高，且顯著高于第II組，葉長顯著高于其它3組，達到顯著性差異；第I組的樹幅、葉長高于第II組，且達到顯著性差異；第II組的樹幅、葉長、葉寬、長寬比值均最低，其中樹高、樹幅、長寬比與第III組未達到顯著性差異。綜合說明，4個組間，樹幅、葉片長、葉片寬等性狀上達到顯著性差異，每組在性狀上都具有一定的群體特征。

3 討論

3.1 金牡丹自然雜交后代遺傳分離情況

金牡丹自然雜交后代與鐵觀音、黃棪的相似系數(shù)值分別為0.691和0.645，說明自然雜交后代更相似于鐵觀音。根據(jù)相似系數(shù)聚類，可將38個自然雜交后代分為4組，4組與鐵觀音、金牡丹、黃棪的相似程度均有不同。其中，第I組內(nèi)品系多為鐵觀音類型，組內(nèi)遺傳多樣性相對較高，可供初步篩選鐵觀音類型的品系；第II組、第III組內(nèi)品系多為金牡丹類型，但第II組與鐵觀音、金牡丹的相似系數(shù)均高于第III組，推測品系性狀優(yōu)于第III組，且組內(nèi)遺傳多樣性高于第III組，說明第II組組內(nèi)材料遺傳差異較大。

3.2 幼齡期性狀分析

根據(jù)分子標(biāo)記聚類結(jié)果，將金牡丹自然雜交后代分為4組后，通過方差計算及多重比較分析，聚類所得的4組品系的不同組間在樹幅、葉長、葉寬、長寬比等性狀上均表現(xiàn)出了顯著的差異，所以可以初步認(rèn)為，EST-SSR分子標(biāo)記可以用于烏龍茶品系個別性狀育種選擇的輔助方法。

圖2 遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig. 2 Dendrogram of genetic similarity coefficient

表2 4個組相似系數(shù)方差分析Table 2 Analysis of variance of similarity coefficient for 4 groups

表3 組內(nèi)遺傳多樣性比較Table 3 Comparison of genetic diversity in the group

表4 4個組幼齡期性狀比較Table 4 Comparison of morphological traits in young stage of four groups

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Analysis of Genetic Diversity Among the Natural Hybrid Prodenies of Jinmudan （Camellia sinensis）

YANG Jun，KONG Xiang-rui，WANG Rang-jian，ZHENG Guo-hua
（Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian 355015，China）

Genetic diversity and relationship among Camellia sinensis “Tie guanyin”, “Huangdan”, and “Jinmudan” and its natural hybrid prodenies, were researched with EST-ESSR markers. Using 14 EST-SSR primers, 62 alleles were generated and its average value was 4.43（ranged between 1 and 7）. The Shannon’s information index and Simpson index were 0.485 and 0.70 respectively. According to the similarity coefficient at 0.73, the natural hybrid progenies of Jinmudan could be clustered into 4 groups. From the results, Group I was a close relative of Tie guanyin. Group II was close related to Jinmudan and expressed the high genetic variation. There were significant differences in tree width, leaf length and leaf width among 4 group progenies of Jinmudan, furthermore, each group possessed a certain group characteristics.

tea plant, natural hybrids, EST-SSR, genetic relationship, genetic diversity

福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（CXTD-1-1302）；

楊軍（1981-），男，碩士，助理研究員，從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究。