王恒葉聿程謝必峰

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350018；2.國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 安溪 362400）

微生物法控制馬尾松樹脂障礙

王恒1葉聿程2謝必峰1

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350018；2.國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建 安溪 362400）

用顆粒失重法測定自制微生物發(fā)酵液降解馬尾松樹脂顆粒的效價(jià)，探討了微生物發(fā)酵液控制馬尾松樹脂障礙的可行性。結(jié)果表明，樹脂顆粒失重量與NaOH滴定量成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.930。試驗(yàn)優(yōu)化了失重法的降解條件：顆粒大小0.2 g，發(fā)酵液量20 mL，溫度60 ℃、pH8下處理12 h。通過5L發(fā)酵罐發(fā)酵，效價(jià)從搖瓶的38.0%提高到50.6%。通過傅里葉紅外光譜測定反應(yīng)前后樹脂成分的變化，有羧酸的產(chǎn)生，并且發(fā)酵液對(duì)樹脂類物質(zhì)中的酯鍵具有裂解作用，因此該發(fā)酵液對(duì)樹脂障礙有明顯控制效果。

失重法 馬尾松 樹脂顆粒 微生物發(fā)酵液 傅里葉紅外光譜

0 前言

我國南方造紙廠所用的木材主要是馬尾松，而馬尾松含有相當(dāng)高的樹脂抽提物，含量甚至可以高達(dá)4%以上[1]。由于馬尾松樹脂會(huì)在制漿中，受到物理或化學(xué)作用被游離出來，粘附在紙張和生產(chǎn)工藝上，從而造成紙張污點(diǎn)，紙片斷頭，設(shè)備效率降低甚至停機(jī)，形成樹脂障礙[2-3]。樹脂障礙主要是甘油三酸酯(TG）造成的，以它為核心，沉積了其他樹脂造成生產(chǎn)上的障礙[4]。

利用酶法可以將樹脂水解成游離的脂肪酸和醇類。這兩種產(chǎn)物親水性較強(qiáng)、黏性低。日本是最早用酶控制樹脂障礙的國家，來自Candida -cylindracea的脂肪酶對(duì)日本紅松磨木漿中TG的分解作用達(dá)到89%[4]。但是這些酶制劑通常價(jià)格昂貴，一定程度上提高了生產(chǎn)成本，所以能夠自主開發(fā)出具有良好降解樹脂障礙的制劑是提高自身競爭力的關(guān)鍵之一。馬尾松樹脂成分復(fù)雜，大多數(shù)酶具有專一性，要想自主開發(fā)獲得具有良好分解樹脂作用的酶制劑并不容易。本試驗(yàn)采用自制的微生物發(fā)酵液對(duì)馬尾松樹脂的降解作用進(jìn)行初步探究。

在研究樹脂障礙控制過程中, 樹脂的定量是該研究必須解決的問題。目前用于測定紙漿中樹脂含量的方法主要有：凝膠滲透色譜、薄層色譜、氣相色譜、13C 核磁共振光譜、高效液相色譜、紫外-可見光譜、氫氧化鈉滴定等[5-6]。本試驗(yàn)室建立的顆粒失重法的原理是微生物制劑直接對(duì)樹脂顆粒的降解，使顆粒失重，測定其前后失重量。該方法的具有操作簡便、速度快等優(yōu)勢，適用于需要大批量測定降解樹脂顆粒效價(jià)的研究工作。本文初步探討利用該方法測定自制微生物發(fā)酵液對(duì)馬尾松樹脂的降解作用,評(píng)價(jià)本項(xiàng)目產(chǎn)品微生物處理液控制馬尾松樹脂障礙的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）馬尾松樹脂：福建嘉豐生物化工有限公司。

（2）微生物發(fā)酵液。

① 種子培養(yǎng)：從試管斜面中接一環(huán)生長良好的菌株至裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min，溫度30 ℃，培養(yǎng)12 h。

② 微生物發(fā)酵液：菌種本課題組提供，發(fā)酵培養(yǎng)基：0.6%酵母粉，0.05%NaNO3，0.45%甘油，1.2% 橄欖油，0.05%MgSO4，0.1%K2HPO4，0.5% 吐溫 80，初始pH 8.0。以4%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量30 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速200r/min，30℃下發(fā)酵38 h，離心收集發(fā)酵上清液。

（3）化學(xué)試劑：除溴化鉀是光譜純，其他均為分析純。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

超級(jí)恒溫槽(上海一恒科技有限公司 MP-501A)，冷凍干燥機(jī)（德國Christ ALPHA 2-4 LD PLUS)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠 RE-52AA)，傅里葉紅外光譜（美國 Nicolet 5700），5L發(fā)酵罐（德國賽多利斯 BIOSTAT Aplus）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 采用顆粒失重法和氫氧化銨（NaOH）滴定法測定微生物發(fā)酵液降解樹脂顆粒的效價(jià)

試驗(yàn)原理：發(fā)酵液可以將樹脂顆粒水解生成游離的脂肪酸，從而使樹脂顆粒質(zhì)量降低和反應(yīng)液中的pH下降。將樹脂顆粒和發(fā)酵液反應(yīng)一段時(shí)間，記錄初始和結(jié)束時(shí)顆粒重量。取3 mL上述反應(yīng)液和3 mL蒸餾水于一小燒杯中，加一滴酚酞作為指示劑，用0.05 mol/NaOH進(jìn)行滴定，酚酞變色為終點(diǎn)，記錄消耗的NaOH的量，以未進(jìn)行反應(yīng)的處理液作為對(duì)照。

2.2 用傅里葉紅外光譜法分析處理前后樹脂的結(jié)構(gòu)變化

按照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

2.3 發(fā)酵液處理樹脂顆粒的相關(guān)性分析試驗(yàn)

在 250mL 錐形瓶內(nèi)加入處理液20mL，pH7.6，加入的樹脂顆粒質(zhì)量有0.4、0.8、1.2 g三種，在50 ℃下處理 4、8、17、24、28 h共20組試驗(yàn)。

2.4 發(fā)酵液處理樹脂顆粒的正交優(yōu)化

在 250 mL 錐形瓶內(nèi)加入一顆0.35 g的樹脂顆粒，發(fā)酵液20 mL，用合適的堿調(diào)節(jié) pH 值到 7.6，50℃下處理 12 h。處理完畢后對(duì)顆粒進(jìn)行稱重，失重率作為發(fā)酵液降解樹脂的效果參數(shù)。在考察顆粒重量、發(fā)酵液量、pH 值和溫度對(duì)處理效果的影響時(shí)，分別只改變對(duì)應(yīng)參數(shù)，而其他參數(shù)保持不變，如表1所示。并且在做pH對(duì)其影響時(shí)，用相對(duì)應(yīng)pH的緩沖溶液作為對(duì)照。每組試驗(yàn)做三個(gè)平行，取平均值。

表1 四種因素所設(shè)的變量

2.5 樹脂待測樣品的處理

發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，進(jìn)行透析得到初步純化的酶液。利用最佳的優(yōu)化條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液通過真空凍干機(jī)16 h將水分抽干，于500 mL索氏抽提器中用正己烷抽提直到液體顏色不再變化為止，通過直接倒出索氏抽提器提取管中的正己烷進(jìn)行濃縮，濃縮后的液體于烘箱中烘干，溶解在20 mL的異丙醇中待測[10-11]。

2.6 發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗(yàn)

5 L小罐中裝液量為2.5 L，接種量4%，攪拌速度250 r/min，通風(fēng)量為1.5 L/min，溫度控制在30 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間38 h，發(fā)酵液離心取上清液。利用優(yōu)化后失重法測其降解馬尾松樹脂的效價(jià)。每隔2 h測發(fā)酵液的OD600，pH、溶氧電極的在線檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 顆粒失重法與NaOH滴定法相關(guān)性分析

顆粒失重法與NaOH滴定法檢測結(jié)果，如表2所示。把數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)算Person相關(guān)系數(shù)，得出耗NaOH量與顆粒失重的相關(guān)系數(shù)為0.930，檢驗(yàn)的顯著性概率為0.000<0.01，拒絕零假設(shè)，表明兩個(gè)變量之間顯著相關(guān)。

表2 20組耗NaOH量和顆粒失重的相關(guān)數(shù)據(jù)

3.2 顆粒失重法單因素研究

3.2.1 顆粒大小、發(fā)酵液用量對(duì)降解馬尾松樹脂的影響

圖1顯示，樹脂顆粒重量在試驗(yàn)范圍內(nèi)，樹脂降解率隨著樹脂顆粒重量的增大而降低，樹脂顆粒重量為0.2g時(shí)降解率最高。當(dāng)樹脂顆粒質(zhì)量越小時(shí)，酶分子就會(huì)與樹脂顆粒結(jié)合更加充分，所以降解率越高。圖2顯示，發(fā)酵液量在試驗(yàn)范圍內(nèi)，樹脂降解率隨著發(fā)酵液量的增大而增大，發(fā)酵液量從10 mL增加到15mL時(shí)降解率增幅明顯，而25mL到30mL基本沒變化。選擇最佳的樹脂顆粒重量范圍為0.2～0.4g，最佳的發(fā)酵液量范圍為15～25mL。

圖1 顆粒大小對(duì)降解馬尾松樹脂的影響

圖2 發(fā)酵液量對(duì)降解馬尾松樹脂的影響

3.2.2 溫度、pH對(duì)降解馬尾松樹脂的影響

圖3顯示，溫度在試驗(yàn)范圍內(nèi)，樹脂降解率隨著溫度的提高而增大，60 ℃時(shí)樹脂降解率達(dá)到最高。由于受到搖床溫度的限制，最高只能設(shè)置到60 ℃，而60 ℃處還沒有下降的趨勢，說明發(fā)酵液起主導(dǎo)作用的酶可能具有高溫酶的特性。在熱磨機(jī)漿生產(chǎn)過程中，溫度達(dá)到80 ℃左右，水解酶具有一定的高溫作用與耐熱性是必備條件[12]。圖4顯示，pH在試驗(yàn)范圍內(nèi)，pH為8.0時(shí)降解率達(dá)到最高。主導(dǎo)酶是一種堿性酶，其最適pH值8.0左右。選擇最佳的溫度范圍為40～60 ℃，最佳的pH范圍為7～10。

圖3 溫度對(duì)降解馬尾松樹脂的影響

圖4 pH對(duì)降解馬尾松樹脂的影響

3.3 發(fā)酵液降解樹脂顆粒的正交優(yōu)化

用 L9（34）正交試驗(yàn)考察了4種因素（pH、樹脂顆粒大小、處理液量、溫度）對(duì)降解率的影響，優(yōu)選出最佳的酶解工藝。表3中通過極差分析表明，樹脂降解的影響作用大小依次為pH 值、顆粒大小、發(fā)酵液量及溫度。因素優(yōu)化組合為顆粒大小0.2 g、處理液量20 mL、溫度60℃、pH8。從表4中均方差分析表明，C因素為0.806最小，對(duì)整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果影響最小，因而把它作為誤差估計(jì)，用以檢驗(yàn)其他因素作用的顯著性。結(jié)果見表5，由均方差分析可知，pH(D)、樹脂顆粒大?。ˋ）對(duì)降解率有顯著性影響（p<0.05）；且p（D)<0.01， p（A）<0.05，則P(B)對(duì)降解率沒有顯著影響，所以因素主次順序?yàn)镈>A>B>C，與極差分析結(jié)果相同。

R Squared =0.994 (Adjusted R Squared = 0.976)

表3 正交試驗(yàn)馬尾松降解率檢測結(jié)果

表4 均方差分析

表5 均方差分析表（Tests of Between-Subjects Effects)

3.4 分解樹脂的紅外光譜分析

制備樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解后的樣品相比未處理樣品黏度明顯降低。處理前后的馬尾松樹脂類物質(zhì)的紅外光譜分析見圖5。從圖5和表6中可見，對(duì)比處理前后紅外譜圖，在1 708 cm-1處C=O的伸縮振動(dòng)，并且在處理后的2圖形中，2 929 cm-1處出現(xiàn)了新的振動(dòng)峰，說明有羧酸產(chǎn)生[9]。那是因?yàn)闃渲诿傅淖饔孟掳l(fā)生水解產(chǎn)生脂肪酸。C=O的伸縮振動(dòng)在1708cm-1處，可能是α，β-不飽和羧酸[13]。處理后1708cm-1處C=O伸展振動(dòng)基團(tuán)、振動(dòng)峰明顯減弱或消失,表明發(fā)酵液對(duì)樹脂類物質(zhì)中的酯鍵的裂解作用。因此發(fā)酵液對(duì)樹脂障礙有明顯控制效果[14]。

表6 樹脂類物質(zhì)的紅外吸收振動(dòng)峰和波數(shù)

圖5 處理前后馬尾松樹脂類物質(zhì)的紅外譜圖

3.5 5L發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵液處理試驗(yàn)

3.5.1 發(fā)酵罐中菌體的生長情況

從圖6中可以看出菌體在6 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，發(fā)酵液中溶氧也隨之急劇下降；到28 h左右開始進(jìn)入穩(wěn)定期，溶氧也隨之上升。本試驗(yàn)是采用不控制溶氧的方法做的，使得菌體在對(duì)數(shù)期的DO極低，后續(xù)可以采用分段控制溶氧的方法。從圖6中的生長曲線可以看出菌體發(fā)酵時(shí)間可能偏短，后續(xù)的試驗(yàn)可以延長發(fā)酵時(shí)間，并且每隔一段時(shí)間進(jìn)行取樣測效價(jià)，以便確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。pH從發(fā)酵前的8.78一直降到發(fā)酵結(jié)束的5.97，可以考慮在中途流加堿性物質(zhì)來維持pH。3.5.2 搖瓶與5 L發(fā)酵罐發(fā)酵液降解馬尾松樹脂效價(jià)的對(duì)比

圖6 5 L發(fā)酵罐中的PO2、pH和OD600

按失重法最佳組合條件進(jìn)行效價(jià)測定。從表7中可看出，搖瓶的發(fā)酵液降解馬尾松樹脂的效價(jià)為38.0%，5L發(fā)酵罐的發(fā)酵液效價(jià)達(dá)到50.6%，提升幅度達(dá)到33.1%。說明罐上的發(fā)酵條件明顯優(yōu)于搖瓶條件，效價(jià)也有顯著的提高，提示該菌有利于工廠化生產(chǎn)。有報(bào)道（葉聿程等）用Enterobacter pulveris.Z75菌株發(fā)酵的發(fā)酵液并利用失重法測得的效價(jià)為23.5%。

表7 搖瓶與5L發(fā)酵罐效價(jià)的對(duì)比

4 結(jié)束語

（1）通過NaOH滴定法驗(yàn)證顆粒失重法，相關(guān)性系數(shù)達(dá)到0.930，顯著相關(guān)，說明顆粒失重法具有可行性。確定了酶解條件的優(yōu)化方案：顆粒大小0.2 g、處理液量20 mL、溫度60 ℃、pH 8，四個(gè)因素中對(duì)降解率影響作用大小依次為pH值、顆粒大小、處理液量、溫度。

（2）通過采用傅里葉紅外光譜對(duì)反應(yīng)前后樹脂的分析，證實(shí)羧酸的產(chǎn)生，并且樹脂類物質(zhì)中的酯鍵發(fā)生裂解。從化學(xué)角度驗(yàn)證該微生物發(fā)酵液對(duì)馬尾松樹脂的分解作用。

（3）通過5L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)，效價(jià)從搖瓶的38.0%提高到50.6%。表明本微生物發(fā)酵液對(duì)馬尾松樹脂障礙處理的工藝技術(shù)，具有良好的應(yīng)用前景。

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福建省造紙學(xué)會(huì)第五屆會(huì)員代表大會(huì)暨第三屆海西紙業(yè)論壇召開

福建省造紙學(xué)會(huì)第五屆會(huì)員代表大會(huì)暨第三屆海西紙業(yè)論壇于2013年11月24日在福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)術(shù)交流中心召開。出席會(huì)議的領(lǐng)導(dǎo)、來賓、代表等共計(jì)132人。

開幕式上，福建省造紙學(xué)會(huì)第四屆理事會(huì)張道沛名譽(yù)理事長代表主辦方致辭；中國造紙學(xué)會(huì)陳學(xué)忠理事長、福建省科協(xié)游建勝副主席、福建農(nóng)林大學(xué)尤民生副校長、福建省經(jīng)貿(mào)委王建副處長等分別發(fā)表熱情洋溢的講話，高度評(píng)價(jià)會(huì)議的召開，并預(yù)祝大會(huì)取得圓滿成功。

福建省輕紡（控股）有限責(zé)任公司、福建省紙業(yè)協(xié)會(huì)、《中華紙業(yè)》雜志社等單位分別派代表出席會(huì)議。福建省民間組織管理局等省內(nèi)外單位分別以不同的方式向會(huì)議召開表示祝賀。

陳學(xué)忠理事長希望福建省造紙學(xué)會(huì)深入學(xué)習(xí)貫徹中央領(lǐng)導(dǎo)同志對(duì)學(xué)會(huì)工作的重要指示精神，堅(jiān)持體制創(chuàng)新，努力培養(yǎng)和提高自身的綜合素質(zhì)，推進(jìn)學(xué)會(huì)有序承接政府轉(zhuǎn)移的職能。他要求福建省造紙學(xué)會(huì)必須把這項(xiàng)工作抓緊、抓實(shí)、抓好。

第五屆會(huì)員代表大會(huì)分別審議并通過“福建省造紙學(xué)會(huì)第四屆理事會(huì)工作報(bào)告”、“福建省造紙學(xué)會(huì)第四屆理事會(huì)財(cái)務(wù)報(bào)告”、“福建省造紙學(xué)會(huì)章程修改說明”、“福建省造紙學(xué)會(huì)章程”、“福建省造紙學(xué)會(huì)規(guī)范化管理文件”。選舉產(chǎn)生第五屆理事會(huì)。

與會(huì)同志一致贊同福建省造紙學(xué)會(huì)今后的職能定位為：組織各種學(xué)術(shù)交流活動(dòng)、出版學(xué)術(shù)期刊、發(fā)表學(xué)術(shù)論文、開展科技教育、承擔(dān)研究和調(diào)研項(xiàng)目、科技中介服務(wù)、科技獎(jiǎng)勵(lì)等。

第五屆一次理事會(huì)分別選出常務(wù)理事會(huì)和正、副理事長及秘書長。福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院黨委書記謝擁群教授當(dāng)選為第五屆理事會(huì)理事長，福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院系主任黃六蓮教授當(dāng)選為秘書長；聘任張道沛同志為名譽(yù)理事長，沈鴻枝、張仲棠、鄭寶琛三位同志為顧問；審議并通過第五屆理事會(huì)各專業(yè)委員會(huì)工作條例及下屬分支機(jī)構(gòu)、代表機(jī)構(gòu)的管理規(guī)定。

福建省紙業(yè)協(xié)會(huì)、芬蘭溫德造紙濕部技術(shù)公司、南紙股份有限公司、福州大學(xué)、福建師范大學(xué)、西門子公司、廈門鴻益順環(huán)?？萍加邢薰镜葐挝辉谡搲戏謩e作專業(yè)報(bào)告、學(xué)術(shù)交流、專題講座。

Microbial Controlling of the Pinus Massoniana Pitch Trouble

WANG Heng1YE Yucheng2XIE Bifeng1
（1.Biotechnology of Fujian Normal University, Fuzhou, Fujian Province, 350018;2.National Tea Quality Supervision and Inspection Center(Fujian), Anxi 362400, Fujian, China）

Measured the valence of handmade microbial degrading the pinus massoniana resin with particle weightlessness method, discussed the feasibility of microbial fermentation broth controlling the pinus massoniana pitch troubles . Results showed that it was linear dependence between the resin particle weightlessness and the titer of sodium hydroxide. The linearly dependent coefficient was 0.930. The experiment optimized the enzymolysis conditions of weightlessness method: particle size 0.2 g, fluid volume 20 mL, temperature 60°, pH8, processed 12 h . The titer increased from 38% in the shaker to 50.6% through fermenting in the 5Lfermentation tank.The ingredient of resins had changed before and after the reaction measuring by the FT-IR Spectrometer, the carboxylic acid produced, and the fermentation broth had the splitting action to the ester bond among the resin kind material. It can be concluded that this fermentation broth had the obvious control effect on the pitch troubles.

weightlessness method；resin particle；microbial fermentation broth；FT-IR Spectrometer