索金偉，戴紹軍

東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040

花粉在柱頭上萌發(fā)后，通過極性生長的花粉管將精細(xì)胞運(yùn)送到胚珠，與卵細(xì)胞結(jié)合完成受精作用?；ǚ酃軜O性生長受多種信號(hào)與代謝過程的調(diào)控，包括Rop GTPase信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、花粉管尖端 Ca2+信號(hào)、肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)變化、囊泡運(yùn)輸以及細(xì)胞壁重塑等[1]，蛋白質(zhì)可逆磷酸化在這些調(diào)控過程中具有重要作用。蛋白激酶或磷酸酶分別將蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基磷酸化或去磷酸化，從而激活或失活該蛋白質(zhì)的功能?？蒲腥藛T已經(jīng)利用分子生物學(xué)與遺傳學(xué)手段揭示了上述過程中多種蛋白質(zhì)的功能受到蛋白質(zhì)可逆磷酸化作用的調(diào)節(jié)(表1)，并利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略鑒定到了779種花粉管生長相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)，它們主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子平衡、細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞壁重塑、核酸和糖代謝、轉(zhuǎn)錄，以及蛋白質(zhì)合成與降解等調(diào)控過程[2～4]。本文綜述了花粉管極性生長過程中通過蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化調(diào)節(jié)的信號(hào)與代謝過程(圖1：A～F)，為進(jìn)一步理解蛋白質(zhì)可逆磷酸化對(duì)花粉管生長的調(diào)控機(jī)制提供了信息。

1 Rop GTPase信號(hào)途徑中蛋白質(zhì)可逆磷酸化

Rop (Rho-related GTPase from plants)是 Rho 亞家族(包括：Cdc42、Rac、Rho、Rop)的成員之一，為植物中所特有的小G蛋白。Rop含有4個(gè)鳥苷酸結(jié)合區(qū)和1個(gè)效應(yīng)器分子結(jié)合區(qū)。Rop 與GTP結(jié)合呈“活化狀態(tài)”，當(dāng) GTP去磷酸化成為 GDP時(shí)，Rop失去GTPase活性。這一可逆磷酸化過程受鳥苷酸交換因子(Guanine nucleotide exchange factor,GEF)、鳥苷酸解離抑制因子(Guanine nucleotide dissociation inhibitor, GDI)和 GTPase活化蛋白(GTPase activating protein, GAP)的調(diào)節(jié)。Rop GTPase信號(hào)途徑對(duì)花粉管極性生長的調(diào)控受蛋白質(zhì)可逆磷酸化調(diào)節(jié)。蛋白激酶與磷酸酶介導(dǎo)的可逆磷酸化作用通過改變GEF、GAP和GDI的活性來調(diào)節(jié)Rop的活性；同時(shí)，蛋白激酶還參與Rop下游途徑的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控花粉管的極性生長(圖1 A)。

1.1 蛋白質(zhì)可逆磷酸化調(diào)節(jié)Rop活性

定位于花粉管尖端質(zhì)膜的Rop的活性受GEF正調(diào)控。GEF催化 Rop GDPase上的 GDP解離并與GTP結(jié)合形成有活性的 Rop GTPase。Rop GTPase通過質(zhì)膜流動(dòng)側(cè)向擴(kuò)散，在生長的花粉管尖端形成Rop GTPase帽。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥(Arabidopsis thaliana(L.) Heynh)花粉中表達(dá)的RhoGEF1、RopGEF8和 RopGEF9能夠激活定位于花粉管尖端質(zhì)膜上的Rop[5,6]。被激活的Rop GTPase受GAP和GDI的負(fù)調(diào)控，從而失去活性，保持有活性Rop和無活性Rop之間的動(dòng)態(tài)平衡[7]。其中，GAP催化 GTP水解成GDP，抑制Rop的活性。然而，GAP本身沒有明顯的膜定位結(jié)構(gòu)域，可能通過接頭/輔助蛋白與細(xì)胞壁組分或與膜脂質(zhì)相連，從而定位在質(zhì)膜上[8]。執(zhí)行完功能的GAP與質(zhì)膜的分離受磷酸化作用調(diào)控。在Ca2+存在的條件下，磷酸化的GAP與14-3-3蛋白結(jié)合后從質(zhì)膜上解離下來，重新定位在細(xì)胞質(zhì)中[9]。利用定點(diǎn)突變的方法，預(yù)測(cè)到煙草(Nicotiana tabacumL.)GAP的 S158為可能的磷酸化位點(diǎn)[9]。失活的 Rop與GDI結(jié)合，從花粉管尖端質(zhì)膜上解離下來形成Rop-GDP-GDI復(fù)合體，儲(chǔ)存在胞質(zhì)中，阻止GDP/GTP的交換[7,10]。Yoon等[9]推測(cè)，GDI可能會(huì)被定位在花粉管尖端質(zhì)膜上的 Ca2+依賴的蛋白激酶(Ca2+-dependent protein kinase 1, CDPK1)磷酸化，導(dǎo)致Rop-GDP-GDI復(fù)合體解體，釋放Rop并使之重新回到質(zhì)膜處，開始Rop激活/失活的新一輪循環(huán)(圖1A)。

表1 與花粉管生長相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)

續(xù)表

GEF的活性受其 C-端可逆磷酸化作用的調(diào)節(jié)。植物 GEF都含有一個(gè)高度保守的 PRONE (Plantspecific Rop nucleotide exchanger)催化結(jié)構(gòu)域和可變的N-/C-端區(qū)域，PRONE參與GDP從Rop-GDP上解離，而N-/C-端則用于調(diào)控GEF自身的活性[11]。GEF的 C-端磷酸化受花粉類受體激酶(Pollen receptor-like kinases, PRKs)的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥 AtPRK2和 AtPRK2a以及番茄(Lycopersicon esculentumL.)LePRK2都能夠與GEF的C-端相互作用并使之磷酸化，解除C-端對(duì) GEF活性的抑制作用[12～14](圖 1A)。對(duì)AtRopGEF12的定點(diǎn)突變表明，AtPRK2a的作用位點(diǎn)可能是S510[12]；而AtPRK2對(duì)RopGEF1的磷酸化作用位點(diǎn)可能是C-端的S460和S480[14]。

多數(shù)花粉 PRKs都由胞外受體結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成。胞外受體結(jié)構(gòu)域是一段富含亮氨酸的重復(fù)序列，能夠與胞外配體結(jié)合，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)，并通過胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域自身磷酸化或磷酸化相應(yīng)的靶蛋白，調(diào)控花粉管極性生長(圖1 A)。另外，近膜區(qū)(Juxtamembrane, JM)和羧基端(Carboxy-terminal, CT)的非催化結(jié)構(gòu)域可能參與受體激酶活性的調(diào)節(jié)。定點(diǎn)突變 LePRK2近膜區(qū)假定磷酸化結(jié)構(gòu)域I上的S277/279/282，以及結(jié)構(gòu)域II上的 S304/307和 T308，結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域 I的磷酸化會(huì)降低激酶的磷酸化活性，抑制花粉管生長；而結(jié)構(gòu)域II的磷酸化則能夠增強(qiáng)激酶的磷酸化活性，促進(jìn)花粉管生長。這兩種結(jié)構(gòu)域磷酸化狀態(tài)之間存在動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)控花粉管的極性生長[15]。同樣，AtPRK2的JM和CT非催化結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渑cGEF的相互作用至關(guān)重要。若全長AtPRK2過表達(dá)，則突變體植株的花粉管生長異常(長度變短且尖端膨大變形)，而 JM和 CT分別被刪除或者兩者同時(shí)被刪除的AtPRK2過表達(dá)植株花粉管生長形態(tài)基本正常[16]。此外，JM和CT還能夠參與調(diào)控PRK的質(zhì)膜定位。熒光標(biāo)記定位研究發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥植株中AtPRK2均勻分布在質(zhì)膜上，在JM被刪除或者JM和CT同時(shí)被刪除的AtPRK2突變體中，AtPRK2在質(zhì)膜上呈斑點(diǎn)狀定位，或者錯(cuò)誤定位到花粉管中運(yùn)動(dòng)的囊泡膜上[16]。

圖1 花粉管極性生長過程中蛋白質(zhì)可逆磷酸化參與的信號(hào)與代謝途徑

目前，人們已經(jīng)鑒定到多種 PRKs編碼基因，如：擬南芥中的AtPRK2和AtPRK2a，矮牽牛(Petunia inflataR. Fries)中的PiPRK1，番茄中的LePRK1、LePRK2和LePRK3，以及玉米(Zea maysL.)中的ZmPRK1等[12,14,17]。在花粉水合前或水合過程中，LePRK1與處于磷酸化狀態(tài)的 LePRK2結(jié)合形成復(fù)合體，定位于花粉管尖端的質(zhì)膜處，并通過其胞外受體結(jié)構(gòu)域與胞外配體(如 LAT52或 SHY)結(jié)合(圖1A)。LAT52是富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，SHY是富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)的蛋白質(zhì)，二者都可以與LePRK2胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成復(fù)合體[18,19]。花粉萌發(fā)后，LAT52與柱頭提取物中的蛋白質(zhì) STIL競(jìng)爭性地與 LePRK2結(jié)合，使 LePRK2去磷酸化，導(dǎo)致LePRKs-LAT52/SHY-STIL復(fù)合體解體釋放出LePRKs單體[20]。從復(fù)合體中釋放的LePRK2可能通過自身磷酸化作用被激活，同時(shí)其胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域能夠磷酸化胞內(nèi)的靶蛋白，并調(diào)控相應(yīng)的下游途徑，控制花粉管的生長。例如，AtPRK2a磷酸化胞內(nèi)的GEF，參與花粉管尖端 Rop的活化[12]。此外，PiPRK1的兩種胞內(nèi)靶蛋白為激酶相互作用蛋白(Kinase interacting protein, PiKIP1)和氧化型膽固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(Oxysterol-binding-protein related protein,PiORP1)[21,22](圖 1A)。PiKIP1定位在花粉或花粉管胞質(zhì)中，具有EF手性結(jié)構(gòu)，可能是一種Ca2+結(jié)合蛋白。PiKIP1與 PiPRK1的胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域相互作用并被磷酸化。PiPRK1的K462位點(diǎn)對(duì)其發(fā)揮激酶活性十分重要。將K462突變成R462后，其與PiKIP1的結(jié)合和磷酸化能力都減弱。目前，這種受磷酸化調(diào)控的PiKIP1在花粉或花粉管中的具體功能還未見報(bào)道[21]。PiORP1在花粉管質(zhì)膜上呈點(diǎn)狀分布，與質(zhì)膜上的PiPRK1相互作用并被磷酸化。PiORP1能夠與質(zhì)膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸結(jié)合(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)，后者可參與磷脂酰肌醇信號(hào)通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放。因此，PiORP1很有可能通過磷酸化作用參與調(diào)控花粉管尖端 Ca2+梯度的形成，但具體的生理功能還有待研究[22]。

1.2 Rop GTPase下游效應(yīng)器分子受磷酸化調(diào)節(jié)

受磷酸化調(diào)控的Rop通過其下游效應(yīng)器分子調(diào)控花粉管極性生長(圖1A)。目前，花粉中Rop下游效應(yīng)器分子主要有以下3類：包含CRIB結(jié)構(gòu)域的Rop相互作用蛋白(Rop-interactive CRIB motif-containing proteins, RICs)、胞質(zhì)類受體激酶(Receptor-like cytoplasmic kinases, RLCK)和Rop相互作用蛋白(Rop interactive partner 1, RIP1/ICR1)[23～25]。這 3 類蛋白質(zhì)分別能夠調(diào)控花粉管生長過程中的肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)、囊泡運(yùn)輸、Ca2+梯度，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。目前只發(fā)現(xiàn)RICs和RLCK參與的途徑受到蛋白質(zhì)可逆磷酸化作用的調(diào)控。百合(Lilium longiflorumL.)花粉表達(dá)的LLP12-2是一種RIC蛋白，定位在花粉管尖端靠近質(zhì)膜區(qū)域的胞質(zhì)中，與活化形式的Rop結(jié)合后，能夠激活花粉管尖端質(zhì)膜處的Ca2+通道，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，參與調(diào)控花粉管尖端Ca2+梯度的形成(圖1A)。LLP12-2過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致花粉管尖端Ca2+濃度過高，從而抑制花粉管的生長。外源添加絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抑制劑能夠緩解LLP12-2過表達(dá)對(duì)花粉管生長的抑制作用，這表明蛋白激酶可能通過調(diào)節(jié) Ca2+信號(hào)參與此抑制過程。因?yàn)?Ca2+依賴的蛋白激酶、鈣調(diào)磷酸酶，以及與其相互作用的蛋白激酶等，既可作為Ca2+的感受器，又能夠參與調(diào)控Ca2+信號(hào)的下游途徑。抑制這兩種蛋白激酶的活性，則可防止過多Ca2+信號(hào)的傳遞，并減緩LLP12-2過表達(dá)對(duì)花粉管生長的抑制[26]。此外，與大多數(shù)受體激酶不同，RLCK僅具有羧基端的激酶結(jié)構(gòu)域，沒有明顯的信號(hào)感知和跨膜結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥 RLCK(AtRLCK VI-A2)能夠與Rop GTPase結(jié)合并被激活，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)受 AtRLCK VI-A2磷酸化調(diào)節(jié)的底物[25]。

2 蛋白質(zhì)可逆磷酸化參與 Ca2+梯度形成以及Ca2+信號(hào)的調(diào)節(jié)

2.1 花粉管尖端 Ca2+梯度形成受蛋白質(zhì)磷酸化作用調(diào)控

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使分子，在花粉管尖端形成一定的濃度梯度。Ca2+梯度主要通過質(zhì)膜 Ca2+通道介導(dǎo)的胞外 Ca2+流入以及胞內(nèi)貯存的Ca2+釋放形成。胞外 Ca2+流入是胞內(nèi) Ca2+梯度的主要來源。在花粉管尖端質(zhì)膜定位的 Ca2+通道中，超極化激活鈣離子通道(Hyperpolarization-activated Ca2+channel, HACC)[27]和環(huán)核苷酸門控離子通道(Cyclic nucleotide-gated channel, CNGC)[28]的活性受蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)節(jié)(圖 1 B)。HACC在鈣調(diào)蛋白(Calmodulin, CaM)引發(fā)的cAMP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)下被激活。在此通路中，胞外基質(zhì)中的CaM可能通過與胞外具有 CaM 結(jié)合位點(diǎn)的 G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)結(jié)合，并激活胞內(nèi)的G蛋白。G蛋白α亞基與去磷酸化的GDP結(jié)合呈非活化狀態(tài)，而與GDP磷酸化產(chǎn)生的GTP結(jié)合時(shí)被激活，被激活的 G蛋白 α亞基與腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase, AC)結(jié)合并使之活化，將ATP去磷酸化轉(zhuǎn)換為 cAMP，第二信使 cAMP能夠與質(zhì)膜處的Ca2+通道HACC結(jié)合，使之激活，介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+梯度的形成[29](圖 1B)。此外，花粉管質(zhì)膜上的CNGCs也能夠介導(dǎo)胞外 Ca2+的流入。植物 CNGCs是一類非選擇性的陽離子通道，由保守的跨膜結(jié)構(gòu)域、C-端環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域3部分組成[30]。花粉表達(dá)的CNGC18定位在花粉管后高爾基體囊泡和尖端質(zhì)膜處，并且 CNGC18在質(zhì)膜上的定位受Rop信號(hào)調(diào)控[28]。在花粉管生長過程中，CNGC18能夠與CDPK32結(jié)合并被磷酸化。磷酸化激活CNGC18的通道蛋白活性，促使Ca2+內(nèi)流，提升胞質(zhì)Ca2+濃度[31](圖1B)。

質(zhì)膜離子通道介導(dǎo)的花粉管尖端 Ca2+濃度的增加能夠激活胞內(nèi) Ca2+敏感的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Phospholipase C, PLC)的活性，從而引發(fā)磷脂酰肌醇信號(hào)通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放[32](圖1：A、B和 D)。在此過程中，磷脂酰肌醇-4-磷酸-5激酶(Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase, PIP5K)與質(zhì)膜處活化的Rop結(jié)合并被激活，被激活的PIP5K磷酸化質(zhì)膜處的磷脂酰肌醇-4-磷酸(Phosphatidylinositol-4-phosphate, PI4P)產(chǎn)生 PIP2[33]。PIP2在活化的 PLC作用下，被水解產(chǎn)生磷脂酰肌醇-1,4,5-三磷酸(Inositol -1,4,5-trisphosphate, IP3)，IP3是一種水溶性分子，通過細(xì)胞溶質(zhì)擴(kuò)散，結(jié)合并打開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上 IP3敏感的 Ca2+通道，引起 Ca2+釋放，提升胞質(zhì)Ca2+濃度[34]。

維持胞內(nèi)適當(dāng)?shù)?Ca2+濃度對(duì)花粉管生長十分必要。植物Ca2+泵(Ca2+-ATPase，ACA)通過ATP去磷酸化水解產(chǎn)生ADP提供能量來介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+的外排。Type-IIB型Ca2+泵——ACA9，定位于擬南芥花粉管質(zhì)膜[35](圖1B)；另一種Type-IIA型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位的Ca2+泵——ACA2，也被發(fā)現(xiàn)在花中表達(dá)(雖然尚未被定位于花粉管)。二者都可以與 Ca2+或 CaM 結(jié)合并被激活，將胞質(zhì)中多余的 Ca2+排出細(xì)胞或泵回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而維持胞內(nèi)適宜的Ca2+濃度[35,36]。ACA2的S45被CDPK1磷酸化后，將不能夠與CaM結(jié)合，從而抑制 Ca2+泵的活性，維持花粉管尖端適宜的Ca2+濃度[37]。

2.2 Ca2+信號(hào)途徑受蛋白激酶調(diào)節(jié)

花粉管尖端的Ca2+信號(hào)由Ca2+感受器感知，并轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)下游系列反應(yīng)，調(diào)控花粉管極性生長[38]。Ca2+感受器包括鈣調(diào)蛋白(Calmodulin, CaM)、鈣調(diào)蛋白類似蛋白(CaM-like, CML)、CDPK及鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(Calcineurin B-like protein, CBL)等。其中，CDPK、CBL及CBL相互作用蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases, CIPKs)通過蛋白質(zhì)磷酸化作用參與Ca2+信號(hào)的調(diào)節(jié)(圖1 B)。CDPK包含一個(gè)CaM類似結(jié)構(gòu)域和一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，結(jié)合Ca2+后被激活，被激活的CDPK通過其激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化下游靶蛋白，參與調(diào)控花粉管生長過程中肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)、Rop信號(hào)以及離子平衡等。例如，玉米中的ZmCDPK可能通過磷酸化相應(yīng)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，調(diào)控花粉管中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化[39](圖1C)。定位在矮牽?；ǚ酃芗舛速|(zhì)膜的PiCDPK1，可能磷酸化GDI，使之激活并參與 Rop信號(hào)調(diào)節(jié)[10]。同樣，擬南芥 AtCDPK17和 AtCDPK34也定位在質(zhì)膜，與PiCDPK1高度同源，可能同樣通過磷酸化作用參與Rop活性的調(diào)節(jié)[40](圖1A)。此外，CDPK還能夠通過磷酸化作用調(diào)控花粉管質(zhì)膜離子通道蛋白的活性，從而維持花粉管內(nèi)的離子平衡。研究發(fā)現(xiàn)，AtCDPK11和AtCDPK24能夠調(diào)節(jié)花粉管質(zhì)膜上內(nèi)向整流 K+通道(Shaker pollen inward K+channel,SPIK)的活性。AtCDPK11和AtCDPK24以復(fù)合體形式存在于花粉管質(zhì)膜上，AtCDPK11與 Ca2+結(jié)合后被激活，并磷酸化AtCDPK24，磷酸化的AtCDPK24可能直接或間接作用于質(zhì)膜上的 SPIK并負(fù)調(diào)控其K+通道活性，阻止花粉管胞外K+的內(nèi)流，維持胞內(nèi)適宜的 K+濃度[41](圖 1B)。與之相似，花粉表達(dá)的AtCDPK2和AtCDPK20定位在花粉管尖端質(zhì)膜，當(dāng)花粉管尖端Ca2+濃度較高時(shí)，二者與Ca2+結(jié)合并被激活，被激活的 AtCDPK2和 AtCDPK20都能夠磷酸化定位在花粉管尖端質(zhì)膜上的陰離子(Cl-/NO3-)通道(Slow anion channel-associated, SLAH3)，介導(dǎo)陰離子(Cl-或NO3-)外流，維持花粉管頂端生長所需的離子梯度[42](圖1B)。另外，PiCDPK2定位于過氧化物酶體，能夠與小 CDPK相互作用蛋白(Small CDPK- interacting protein1, PiSCP1)結(jié)合并使其S16和 S92磷酸化(圖 1B)，同時(shí)過表達(dá) PiCDPK2和PiSCP1會(huì)抑制花粉管的生長，但其具體作用機(jī)制還不清楚[43,44]。

CBL作為Ca2+信號(hào)的感受器，與CIPKs相互作用形成復(fù)合體。感知 Ca2+信號(hào)后，CIPKs能夠磷酸化下游靶蛋白，調(diào)控相應(yīng)的下游途徑[38]。目前，花粉中已鑒定到的 CBLs包括 AtCBL1、AtCBL9、AtCBL2以及AtCBL3等。其中，AtCBL1和AtCBL9參與調(diào)控花粉管內(nèi)的離子平衡，尤其是調(diào)控K+平衡。研究發(fā)現(xiàn)，CBL1和CBL9平均分布在花粉管質(zhì)膜處，在花粉管尖端 Ca2+濃度較高的區(qū)域被局部激活。被激活的 CBL1和 CBL9能夠促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中K+的吸收[45](圖1B)。在擬南芥幼苗和根尖中，當(dāng)胞內(nèi) K+濃度較低時(shí)，CBL1/9與胞質(zhì)中的CIPK23結(jié)合使之錨定到質(zhì)膜上，質(zhì)膜定位的CIPK23能夠磷酸化 shaker家族 K+通道 AKT1，磷酸化的AKT1激活其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，促進(jìn)K+的吸收[46]。并且，AKT1同源的shaker家族K+通道SPIK在花粉或花粉管中表達(dá)，若SPIK被破壞，突變體植株中K+的內(nèi)向流動(dòng)受到嚴(yán)重影響，并且花粉管的生長也受到抑制[47]。由此推測(cè)，花粉表達(dá)的 CBL1/9同樣是通過磷酸化作用調(diào)控花粉管中SPIK的活性，進(jìn)而調(diào)控花粉管生長過程中胞內(nèi)K+的平衡(圖1B)。此外，通過綠色熒光蛋白標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，AtCBL2和AtCBL3在花粉管中的定位隨著花粉管的生長會(huì)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，但尚未發(fā)現(xiàn)與其相互作用的蛋白激酶CIPK[38]。

3 蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)的調(diào)控

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可為花粉管胞質(zhì)環(huán)流、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)以及囊泡運(yùn)輸提供分子軌道，對(duì)花粉管極性生長至關(guān)重要。肌動(dòng)蛋白束的組裝和去組裝受到多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)[48]。外源添加蛋白磷酸酶抑制劑會(huì)導(dǎo)致百合花粉管肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架分布異常，使花粉管生長失去極性[49,50]，這表明肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的活性可能受到磷酸化調(diào)節(jié)，從而調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。參與肌動(dòng)蛋白解聚的 Profilin和肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白(Actin depolymerizing factor/cofilin, ADF/cofilin) 家族中ADF的活性受磷酸化作用調(diào)控(圖 1 C)。植物中多數(shù) Profilin都含有一個(gè)絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)磷酸化結(jié)構(gòu)域和一個(gè) MAPK相互作用結(jié)構(gòu)域(MAP kinase interaction motif, KIM)。對(duì)煙草 Profilin(NtProf2)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花粉水合后，煙草花粉表達(dá)的MAPKK(NtMEK2)能夠磷酸化 MAPK(P45Ntf4和SIPK)，被激活的P45Ntf4和SIPK能夠磷酸化NtProf2的T114(圖1 C)。然而，NtProf2的磷酸化對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待研究[51,52]。ADF/cofilin的主要功能是通過水解ATP提供能量，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白解聚。ADF/cofilin既能夠與球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)結(jié)合，又能夠與纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)結(jié)合，促使ADP-G-actin從肌動(dòng)蛋白絲上解聚下來，加速肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)變化[53]?；ǚ郾磉_(dá)的NtADF1以磷酸化和非磷酸化兩種形式存在，S6磷酸化會(huì)抑制NtADF1的活性。如果將NtADF1的S6突變?yōu)闆]有磷酸化能力的 A6，NtADF1(S6A)的活性增加，然而將 S6突變成模擬磷酸化的 D6，NtADF1(S6D)活性受到抑制，不能與G/F-actin結(jié)合[54](圖 1C)。NtADF1磷酸化與非磷酸化之間的動(dòng)態(tài)平衡受Rop GTPase調(diào)控。過表達(dá)NtRac1會(huì)削弱NtADF1與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合能力，導(dǎo)致煙草花粉管的生長失去極性，花粉管尖端膨脹并且肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架分布異常，但不影響 NtADF1(S6A)與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合能力。過表達(dá)NtADF1(S6A)能夠抵消NtRac1過表達(dá)產(chǎn)生的花粉管去極化生長的表型，但NtADF1(S6D)過表達(dá)無法抵消NtRac1過表達(dá)的表型[54]。Rop GTPase對(duì)ADF活性的調(diào)控可能通過膜磷脂PI4P和PIP2完成。Rop GTPase激活PIP5K的蛋白激酶活性，PIP5K磷酸化PI4P產(chǎn)生PIP2。PIP2被質(zhì)膜處的PLC水解產(chǎn)生IP3，IP3誘導(dǎo)花粉管尖端Ca2+梯度的形成，并可能通過下游CDPK調(diào)控ADF磷酸化與非磷酸化狀態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡(圖 1C)。研究表明，非花粉表達(dá)的ZmADF3的S6被CDPK磷酸化，但花粉中ADF磷酸化是否受CDPK調(diào)控，以及CDPK是否直接磷酸化ADF，或者CDPK通過磷酸化其他蛋白質(zhì)來間接磷酸化ADF，都有待進(jìn)一步研究[55]。另外，PIP2也能跟肌動(dòng)蛋白競(jìng)爭性地與ADF結(jié)合，當(dāng)ADF與PIP2結(jié)合后，則不能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，進(jìn)而影響肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)平衡[56]。此外，Rop下游效應(yīng)器分子RIC4很有可能通過調(diào)節(jié)某種激酶使ADF磷酸化，從而抑制肌動(dòng)蛋白解聚。若過表達(dá)RIC4與熒光標(biāo)記的ADF，ADF則不再與肌動(dòng)蛋白相互作用，熒光信號(hào)大部分在胞質(zhì)中被檢測(cè)到。但RIC4下游的激酶以及具體的磷酸化機(jī)制還有待驗(yàn)證[57]。

4 蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)

在極性生長的花粉管中，分泌囊泡在倒噴泉式的胞質(zhì)環(huán)流驅(qū)動(dòng)下，沿著花粉管兩側(cè)運(yùn)輸?shù)郊舛顺实瑰F型密集分布，通過極性胞吐作用為花粉管細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的生長提供原料[58]，而胞吞作用可以介導(dǎo)多余膜組分與細(xì)胞壁材料等的回收再利用，還能夠吸收營養(yǎng)成分以及柱頭分泌的信號(hào)分子，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)外物質(zhì)和信號(hào)的交流[58]。極性的胞吞/胞吐作用是在時(shí)空上相互關(guān)聯(lián)的周期性調(diào)控過程。在此過程中，蛋白質(zhì)可逆磷酸化參與調(diào)節(jié)胞吞/胞吐相關(guān)蛋白質(zhì)的活性，還能夠調(diào)控質(zhì)膜的磷脂代謝(圖1 D)。

花粉中已鑒定到了多種胞吞/胞吐相關(guān)蛋白質(zhì)。其中，VAMP721和VAMP726是矮牽?；ǚ郾磉_(dá)的兩種小泡相關(guān)膜蛋白(Vesicle-associated membrane protein 7, VAMP7)，屬于 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白家族。研究表明，PiVAMP721和 PiVAMP726定位在花粉管頂端的運(yùn)輸囊泡，介導(dǎo)內(nèi)吞過程中內(nèi)吞囊泡之間，內(nèi)吞囊泡和內(nèi)涵體，內(nèi)吞囊泡和胞吐囊泡之間的膜融合[43,59]。PiVAMP721的活性受磷酸化作用的負(fù)調(diào)控(圖 1D)。位于 PiVAMP721的 N-端結(jié)構(gòu)域上的S42可能是一個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，將S42突變?yōu)闆]有磷酸化能力的A42后，PiVAMP721的膜融合能力顯著增強(qiáng)，突變體的花粉管長度較短。而將 S42突變?yōu)槟M磷酸化的 E42后，PiVAMP721的膜融合能力明顯降低，突變體的花粉管長度也顯著增長[43]。

極性胞吞/胞吐作用受多種因素調(diào)節(jié)，包括花粉管中肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)、Ca2+梯度、Rop GTPase以及磷脂酰肌醇等[60,61]。其中，蛋白質(zhì)可逆磷酸化作用可以通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜上PIP2及其代謝產(chǎn)物磷脂酸(Phosphatidic acid, PA)的代謝過程，參與調(diào)控花粉管生長過程中的極性胞吞/胞吐作用(圖1D)。研究發(fā)現(xiàn)，PIP2不僅能夠參與花粉管尖端的胞吐作用，還能夠參與調(diào)控網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞過程。若過表達(dá)定位于花粉管尖端質(zhì)膜的AtPIP5K4、AtPIP5K5和NtPIP5K6，都會(huì)導(dǎo)致花粉管質(zhì)膜產(chǎn)生過多的 PIP2，造成胞吐作用過度發(fā)生，使得花粉管尖端果膠沉積過多，細(xì)胞壁增厚。過多的PIP2還會(huì)導(dǎo)致內(nèi)吞作用過度發(fā)生，造成花粉管尖端質(zhì)膜大量內(nèi)陷且嚴(yán)重變形[62～64]。此外，PIP2還能夠被體內(nèi)的 PLC水解產(chǎn)生二酰甘油(Diacylglycerol,DAG)，DAG可被二酰甘油激酶(Diacylglycerol kinases, DGKs)磷酸化產(chǎn)生 PA，同時(shí)磷脂酶 D(Phospholipase D, PLD)也能夠直接水解DAG產(chǎn)生PA。PA在脂質(zhì)磷酸磷酸酶(Lipid phosphate phosphatases, LPPs)的作用下，去磷酸化重新生成DAG(圖1D)。在煙草花粉管中，PA能夠參與分泌囊泡與質(zhì)膜的融合過程。如果抑制PLD的水解酶和DGK的激酶活性，會(huì)阻礙PA的合成，減少煙草花粉管中分泌囊泡與質(zhì)膜的融合、破壞尖端果膠的沉積并抑制花粉管的生長，而抑制LPP的磷酸酶活性，會(huì)導(dǎo)致PA積累，促進(jìn)胞吐作用并有利于花粉管生長[65]。

5 蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控花粉管細(xì)胞壁重塑

花粉管頂端生長依賴于細(xì)胞壁材料及其前體物質(zhì)向尖端運(yùn)輸，細(xì)胞壁重塑是花粉管極性生長的前提[66]。多數(shù)植物花粉管細(xì)胞壁外層由機(jī)械強(qiáng)度較高的果膠層組成，內(nèi)層主要由胼胝質(zhì)沉積而成；此外，花粉管細(xì)胞壁還包含少量纖維素和半纖維素，根據(jù)物種的不同，二者或者與果膠層相連，或者與胼胝質(zhì)層相連，或者形成介于果膠層和胼胝質(zhì)層之間獨(dú)立的第三層[67,68]。花粉中已鑒定到多種細(xì)胞壁重塑相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要參與果膠合成與修飾、纖維素與胼胝質(zhì)合成、蔗糖合成等過程。其中，細(xì)胞壁相關(guān)激酶(Wall associate kinase, WAK)是一種細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，利用跨膜結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞壁果膠層共價(jià)相聯(lián)。在花粉管生長過程中，可能通過胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化下游底物參與調(diào)控相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[67]。此外，蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化也能夠調(diào)節(jié)胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(The PTI1-like kinase, ZmPti1a)和蔗糖合酶(Sucrose synthase, Sus)在花粉管中的功能以及分布模式，參與花粉管細(xì)胞壁重塑[69,70](圖1 E)。

花粉管細(xì)胞壁胼胝質(zhì)的合成主要受胼胝質(zhì)合酶(Callose synthase, CalS)催化，研究發(fā)現(xiàn)，植物中CalS與UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose transferase，UGT)結(jié)合并形成復(fù)合體，受PRK2激活的Rop-GTPase通過與UGT結(jié)合，進(jìn)而激活CalS[71]。ZmPti1a編碼一種胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與PRK相似，既能夠發(fā)生自身磷酸化，又可作為其他蛋白激酶的底物(圖1E)。在花粉萌發(fā)過程中，ZmPti1a特異性定位于花粉或花粉管質(zhì)膜胼胝質(zhì)沉積處，Herrmann等[69]推測(cè)ZmPti1a能夠利用其胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域調(diào)控CalS的活性，參與花粉管細(xì)胞壁胼胝質(zhì)合成。

Sus是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，催化二磷酸尿苷(Uridine diphosphate, UDP)和蔗糖生成果糖和UDP-葡萄糖(UDP-glucose, UDPG)的可逆反應(yīng)。植物中Sus以磷酸化和非磷酸化兩種形式存在，并且定位不同。非磷酸化的 Sus與膜相連，磷酸化會(huì)降低 Sus表面疏水性，使其從膜上脫離下來游離到胞質(zhì)中[72](圖 1E)?；ǚ酃苌L過程中，外界蔗糖被細(xì)胞壁蔗糖酶(Cell wall invertase, CWI)水解成葡萄糖和果糖，或者被質(zhì)膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sucrose transporter,SUT)直接轉(zhuǎn)運(yùn)到花粉管內(nèi)。葡萄糖和果糖在胞質(zhì)非磷酸化狀態(tài)的 Sus作用下重新合成蔗糖，游離的蔗糖又會(huì)被與膜相連的磷酸化形式的 Sus裂解產(chǎn)生UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖則可作為胼胝質(zhì)和纖維素合成的前體物質(zhì)，參與花粉管細(xì)胞壁的構(gòu)建[70](圖1E)。玉米葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Sus的 S15被CDPK磷酸化[73]。但花粉中調(diào)控 Sus磷酸化的激酶以及潛在磷酸化位點(diǎn)的鑒定都還有待進(jìn)一步研究。

6 蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)基因表達(dá)與蛋白質(zhì)命運(yùn)的調(diào)節(jié)

有研究認(rèn)為花粉管生長所需的蛋白質(zhì)來源于成熟花粉中貯存的mRNA[74]，但也有研究認(rèn)為成熟花粉中貯存的mRNA不足以滿足不斷生長的花粉管的需求，需要新合成mRNA[75]。在花粉中已經(jīng)鑒定到了參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多種轉(zhuǎn)錄因子和 Ca2+依賴的蛋白激酶相互作用蛋白(OsCPDK25/26-interacting protein 30, OIP30)。其中，水稻(Oryza sativaL.)花粉中表達(dá)的 OIP30是一種受 OsCDPK25/26磷酸化調(diào)節(jié)的DNA解旋酶，定位于細(xì)胞質(zhì)，而OsCDPK25/26既具有膜定位相關(guān)的豆蔻?；盘?hào)又具有核定位信號(hào)。在花粉管生長過程中，定位在膜上的OsCDPK25/26感知Ca2+信號(hào)后被激活，與OIP30結(jié)合并從膜上水解下來，攜帶OIP30進(jìn)入細(xì)胞核。OsCDPK25/26將其磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給OIP30使其磷酸化，激活OIP30的解旋酶和ATPase活性，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[74](圖1 F)。

此外，在花粉中也鑒定到了參與蛋白質(zhì)合成和降解相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，真核生物翻譯起始因子4A(Eukaryotic translation initiation factor 4A, eIF4A)屬于 RNA解旋酶 DEAD-box 家族，是翻譯起始因子復(fù)合體eIF4F(包括eIF4A、eIF4E、以及eIF4G)的一個(gè)亞基，能夠與起始因子eIF4B或eIF4H相互作用，后兩者能夠增強(qiáng)eIF4A的解旋酶活性。在蛋白質(zhì)翻譯起始階段，eIF4A利用ATP水解提供能量，解開mRNA 5′-UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)40S核糖體小亞基與 mRNA結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯過程(圖 1F)。eIF4A8是花粉中特異性表達(dá)的eIF4A的一個(gè)亞型，在花粉萌發(fā)過程中，eIF4A8的蘇氨酸殘基被磷酸化[76]，然而磷酸化對(duì)eIF4A8的活性及功能的調(diào)節(jié)還不清楚。

7 結(jié)語與展望

花粉管極性生長是植物有性生殖的重要環(huán)節(jié)，可逆磷酸化作用作為生物體內(nèi)最為普遍和重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，對(duì)花粉管極性生長的調(diào)節(jié)受到人們?cè)絹碓綇V泛的關(guān)注。人們已經(jīng)利用分子生物學(xué)與遺傳學(xué)手段研究并發(fā)現(xiàn)了花粉管生長過程中多種受磷酸化調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，并對(duì)潛在的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，明確了花粉管生長過程中磷酸化作用對(duì)蛋白質(zhì)活性、功能與分布模式的調(diào)節(jié)，為認(rèn)識(shí)花粉管極性生長的分子機(jī)制提供了新的信息。

花粉管的極性生長受多種信號(hào)和代謝過程共同調(diào)控，包括Rop GTPase信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、Ca2+信號(hào)、肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)變化、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞壁重塑等，每個(gè)過程都極為復(fù)雜，并且各個(gè)過程之間也存在著時(shí)空上的相互聯(lián)系。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的磷酸化相關(guān)蛋白質(zhì)還遠(yuǎn)不能清晰地解釋花粉管極性生長的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)作為高通量的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究手段，為深入分析花粉蛋白質(zhì)磷酸化提供了重要信息。今后，進(jìn)一步利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)等技術(shù)策略深入分析花粉管極性生長過程中蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)及其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，將為揭示花粉管極性生長的分子機(jī)制提供新的證據(jù)。

[1]Qin Y, Yang ZB. Rapid tip growth: insights from pollen tubes.Semin Cell Dev Biol, 2011, 22(8): 816–824.

[2]Chen YM, Liu P, Hoehenwarter W, Lin JX. Proteomic and phosphoproteomic analysis ofPicea wilsoniipollen development under nutrient limitation.J Proteome Res, 2012,11(8): 4180–4190.

[3]Fíla J, Matros A, Radau S, Zahedi RP, ?apková V, Mock HP, Honys D. Revealing phosphoproteins playing role in tobacco pollen activatedin vitro.Proteomics, 2012,12(21): 3229–3250.

[4]Mayank P, Grossman J, Wuest S, Boisson-Dernier A, Roschitzki B, Nanni P, Nühse T, Grossniklaus U. Characterization of the phosphoproteome of matureArabidopsispollen.Plant J, 2012, 72(1): 89–101.

[5]Gu Y, Li SD, Lord EM, Yang ZB. Members of a novel class ofArabidopsisRho guanine nucleotide exchange factors control Rho GTPase-dependent polar growth.Plant Cell, 2006, 18(2): 366–381.

[6]Li ZX, Liu D. ROPGEF1 and ROPGEF4 are functional regulators of ROP11 GTPase in ABA-mediated stomatal closure inArabidopsis.FEBS Lett, 2012, 586(9): 1253–1258.

[7]Hwang JU, Wu G, Yan A, Lee YJ, Grierson CS, Yang ZB.Pollen-tube tip growth requires a balance of lateral propagation and global inhibition of Rho-family GTPase activity.J Cell Sci, 2010, 123(3): 340–350.

[8]Klahre U, Kost B. Tobacco RhoGTPase ACTIVATING PROTEIN1 spatially restricts signaling of RAC/Rop to the apex of pollen tubes.Plant Cell, 2006, 18(11): 3033–3046.

[9]Yoon GM, Dowd PE, Gilroy S, McCubbin AG. Calcium-dependent protein kinase isoforms inPetuniahave distinct functions in pollen tube growth, including regulating polarity.Plant Cell, 2006, 18(4): 867–878.

[10]Klahre U, Becker C, Schmitt AC, Kost B. Nt-RhoGDI2 regulates Rac/Rop signaling and polar cell growth in tobacco pollen tubes.Plant J, 2006, 46(6): 1018–1031.

[11]Berken A., Thomas C, Wittinghofer A. A new family of RhoGEFs activates the Rop molecular switch in plants.Nature, 2005, 436(7054): 1176–1180.

[12]Zhang Y, McCormick S. A distinct mechanism regulating a pollen-specific guanine nucleotide exchange factor for the small GTPase Rop inArabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(47): 18830–18835.

[13]Zhang D, Wengier D, Shuai B, Gui CP, Muschietti J,McCormick S, Tang WH. The pollen receptor kinase LePRK2 mediates growth-promoting signals and positively regulates pollen germination and tube growth.Plant Physiol, 2008, 148(3): 1368–1379.

[14]Chang F, Gu Y, Ma H, Yang ZB. AtPRK2 promotes ROP1 activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth.Mol Plant, 2013, 6(4): 1187–1201.

[15]Salem T, Mazzella A, Barberini ML, Wengier D, Motillo V, Parisi G, Muschietti J. Mutations in two putative phosphorylation motifs in the tomato pollen receptor kinase LePRK2 show antagonistic effects on pollen tube length.J Biol Chem, 2011, 286(6): 4882–4891.

[16]Zhao XY, Wang Q, Li S, Ge FR, Zhou LZ, McCormick S,Zhang Y. The juxtamembrane and carboxy-terminal domains ofArabidopsisPRK2 are critical for ROP-induced growth in pollen tubes.J Exp Bot, 2013, 64(18): 5599–5610.

[17]Mu JH, Lee HS, Kao TH. Characterization of a pollen-expressed receptor-like kinase gene ofPetunia inflataand the activity of its encoded kinase.Plant Cell, 1994,6(5): 709–721.

[18]Tang W, Ezcurra I, Muschietti J, McCormick S. A cysteine-rich extracellular protein, LAT52, interacts with the extracellular domain of the pollen receptor kinase LePRK2.Plant Cell, 2002, 14(9): 2277–2287.

[19]Guyon V, Tang WH, Monti MM, Raiola A, Lorenzo GD,McCormick S, Taylor LP. Antisense phenotypes reveal a role for SHY, a pollen-specific Leucine-rich repeat protein,in pollen tube growth.Plant J, 2004, 39(4): 643–654.

[20]Wengier DL, Mazzella MA, Salem TM, McCormick S,Muschietti JP. STIL, a peculiar molecule from styles, specifically dephosphorylates the pollen receptor kinase LePRK2 and stimulates pollen tube growthin vitro.BMC Plant Biol, 2010, 10(1): 33.

[21]Skirpan AL, McCubbin AG, Ishimizu T, Wang X, Hu Y,Dowd PE, Ma H, Kao TH. Isolation and characterization of kinase interacting protein 1, a pollen protein that interacts with the kinase domain of PRK1, a receptor-like kinase ofpetunia.Plant Physiol, 2001, 126(4): 1480–1492.

[22]Skirpan AL, Dowd PE, Sijacic P, Jaworski CJ, Gilroy S,Kao TH. Identification and characterization of PiORP1, aPetuniaoxysterol-binding-protein related protein involved in receptor-kinase mediated signaling in pollen, and analysis of the ORP gene family inArabidopsis.Plant Mol Biol, 2006, 61(4–5): 553–565.

[23]Wu G, Gu Y, Li SD, Yang ZB. A genome-wide analysis ofArabidopsisRop-interactive CRIB motif-containing proteins that act as Rop GTPase targets.Plant Cell, 2001,13(12): 2841–2856.

[24]Li S, Gu Y, Yan A, Lord E, Yang ZB. RIP1 (ROP Interactive Partner 1)/ICR1 marks pollen germination sites and may act in the ROP1 pathway in the control of polarized pollen growth.Mol Plant, 2008, 1(6): 1021–1035.

[25]Jurca ME. Characterization of ROP GTPase-activatedArabidopsisreceptor-like cytoplasmic kinases (RLCK class VI_A). Hungary: Hungarian Academy of Sciences,2011.

[26]Hsu, SW, Wang CS. Lily Cdc42/Rac-interactive binding motif-containing protein, a Rop target, involves calcium influx and phosphoproteins during pollen germination and tube growth.Plant Signal Behav, 2010, 5(11): 1460–1463.

[27]Qu HY, Shang ZL, Zhang SL, Liu LM, Wu JY. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes ofPyrus pyrifolia.New Phytol, 2007,174(3): 524–536.

[28]Chang F, Yan A, Zhao LN, Wu WH, Yang ZB. A putative calcium-permeable cyclic nucleotide-gated channel, CNGC18,regulates polarized pollen tube growth.J Integr Plant Biol,2007, 49(8): 1261–1270.

[29]Wu YS, Xu XD, Li SJ, Liu T, Ma LG, Shang ZG. Heterotrimeric G-protein participation inArabidopsispollen germination through modulation of a plasma membrane hyperpolarization-activated Ca2+-permeable channel.New Phytol, 2007, 176(3): 550–559.

[30]Kaupp UB, Seifert R. Cyclic nucleotide-gated ion channels.PhysiolRev, 2002, 82(3): 769–824.

[31]Zhou LM, Lan WZ, Jiang YQ, Fang W, Luan S. A Calcium-dependent protein kinase interacts with and activates a calcium channel to regulate pollen tube growth.Mol Plant, 2013, 7(2): 369–376.

[32]Franklin-Tong VE, Drobak BK, Allan AC, Watkins P,Trewavas AJ. Growth of pollen tubes ofPapaver rhoeasis regulated by a slow-moving calcium wave propagated by inositol 1, 4, 5-trisphosphate.PlantCell, 1996, 8(8): 1305–1321.

[33]Kost B, Lemichez E, Spielhofer P, Hong Y, Tolias K,Carpenter C, Chua NH. Rac homologues and compartmentalized phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate act in a common pathway to regulate polar pollen tube growth.J Cell Biol, 1999, 145(2): 317–330.

[34]Monteiro D, Liu Q, Lisboa S, Scherer GE, Quader H,Malhó R. Phosphoinositides and phosphatidic acid regulate pollen tube growth and reorientation through modulation of [Ca2+]cand membrane secretion.J Exp Bot, 2005,56(416): 1665–1674.

[35]Schi?tt M, Romanowsky SM, B?kgaard L, Jakobsen MK,Palmgren MG, Harper JF. A plant plasma membrane Ca2+pump is required for normal pollen tube growth and fertilization.Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(25): 9502–9507.

[36]Harper JF, Hong B, Hwang I, Guo HQ, Stoddard R, Huang JF, Palmgren MG, Sze H. A novel calmodulin-regulated Ca2+-ATPase (ACA2) fromArabidopsiswith an N-terminal autoinhibitory domain.J Biol Chem, 1998, 273(2):1099–1106.

[37]Hwang I, Sze H, Harper JF. A calcium-dependent protein kinase can inhibit a calmodulin-stimulated Ca2+pump(ACA2) located in the endoplasmic reticulum ofArabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(11): 6224–6229.

[38]Zhou LM, Fu Y, Yang ZB. A genome-wide functional characterization ofArabidopsisregulatory calcium sensors in pollen tubes.J Integr Plant Biol, 2009, 51(8): 751–761.

[39]Estruch JJ, Kadwell S, Merlin E, Crossland L. Cloning and characterization of a maize pollen-specific calcium-dependent calmodulin-independent protein kinase.Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(19): 8837–8841.

[40]Myers C, Romanowsky SM, Barron YD, Garg S, Azuse CL, Curran A, Davis RM, Hatton J, Harmon AC, Harper JF. Calcium-dependent protein kinases regulate polarized tip growth in pollen tubes.Plant J, 2009, 59(4): 528–539.

[41]Zhao LN, Shen LK, Zhang WZ, Zhang W, Wang Y, Wu WH. Ca2+-dependent protein kinase11 and 24 modulate the activity of the inward rectifying K+channels inArabidopsispollen tubes.Plant Cell, 2013, 25(2): 649–661.

[42]Gutermuth T, Lassig R, Portes MT, Maierhofer T, Romeis T, Borst JW, Hedrich R, Feijó JA, Konrad KR. Pollen tube growth regulation by free anions depends on the interaction between the anion channel SLAH3 and calcium-dependent protein kinases CPK2 and CPK20.Plant Cell, 2013,25(11): 4525–4543.

[43]Guo F. Investigation into the functions of the pollen specific genes PiVAMP721 and PiSCP1 in pollen tube growth.Washington: Washington State University, 2008.

[44]Guo F, Yoon GM, McCubbin AG. PiSCP1 and PiCDPK2 Localize to peroxisomes and are involved in pollen tube growth inPetunia Inflata.Plants, 2013, 2(1): 72–86.

[45]M?hs A, Steinhorst L, Han JP, Shen LK, Wang Y, Kudla J.The Calcineurin B-like Ca2+sensors CBL1 and CBL9 function in pollen germination and pollen tube growth inArabidopsis.Mol Plant, 2013, 6(4): 1149–1162.

[46]Xu J, Li HD, Chen LQ, Wang Y, Liu LL, He L, Wu WH.A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+transporter AKT1 inArabidopsis.Cell, 2006, 125(7): 1347–1360.

[47]Mouline K, Véry AA, Gaymard F, Boucherez J, Pilot G,Devic M, Bouchez D, Thibaud JB, Sentenac H. Pollen tube development and competitive ability are impaired by disruption of a Shaker K+channel inArabidopsis.Genes Dev, 2002, 16(3): 339–350.

[48]Ren HY, Xiang Y. The function of actin-binding proteins in pollen tube growth.Protoplasma, 2007, 230(3–4): 171–182.

[49]Foissner I, Grolig F, Obermeyer G. Reversible protein phosphorylation regulates the dynamic organization of the pollen tube cytoskeleton: effects of calyculin A and okadaic acid.Protoplasma, 2002, 220(1–2): 1–15.

[50]Zi HJ, Xiang Y, Li M, Wang T, Ren HY. Reversible protein tyrosine phosphorylation affects pollen germination and pollen tube growth via the actin cytoskeleton.Protoplasma, 2007, 230(3–4): 183–191.

[51]Limmongkon A, Giuliani C, Valenta R, Mittermann I,Heberle-Bors E, Wilson C. MAP kinase phosphorylation of plant profilin.Biochem Bioph Res Commun, 2004, 324(1):382–386.

[52]Voronin V, Aionesei T, Limmongkon A, Barinova I, Touraev A, Laurière C, Coronado MJ, Testillano PS, Risue?o MC, Heberle-Bors E, Wilson C. The MAP kinase kinase NtMEK2 is involved in tobacco pollen germination.FEBS Lett, 2004, 560(1): 86–90.

[53]Carlier MF, Laurent V, Santolini J, Melki R, Didry D, Xia GX, Hong Y, Chua NH, Pantaloni D. Actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) enhances the rate of filament turnover: implication in actin-based motility.J Cell Biol,1997, 136(6): 1307–1322.

[54]Chen CY, Cheung AY, Wu HM. Actin-depolymerizing factor mediates Rac/Rop GTPase–regulated pollen tube growth.Plant Cell, 2003, 15(1): 237–249.

[55]Allwood EG, Smertenko AP, Hussey PJ. Phosphorylation of plant actin-depolymerising factor by calmodulin-like domain protein kinase.FEBS Lett, 2001, 499(1–2): 97–100.

[56]Ischebeck T, Stenzel I, Hempel F, Jin X, Mosblech A,Heilmann I. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate influences Nt-Rac5-mediated cell expansion in pollen tubes ofNicotiana tabacum.Plant J, 2011, 65(3): 453–468.

[57]Chudnovskiy A. Analysis of an Actin Binding Guanine Exchange Factor, GEF8, and Actin depolymerizing factor inArabidopsis Thaliana. America: University of Massachusetts Amherst, 2010.

[58]Derksen J, Rutten T, Lichtscheidl IK, de Win AHN, Pierson ES, Rongen G. Quantitative analysis of the distribution of organelles in tobacco pollen tubes: implications for exocytosis and endocytosis.Protoplasma, 1995, 188(3–4):267–276.

[59]Guo F, McCubbin AG. The pollen-specific R-SNARE/longin PiVAMP726 mediates fusion of endo-and exocytic compartments in pollen tube tip growth.J Exp Bot, 2012,63(8): 3083–3095.

[60]Zhang Y, McCormick S. The regulation of vesicle trafficking by small GTPases and phospholipids during pollen tube growth.Sex Plant Reprod, 2010, 23(2): 87–93.

[61]Zhang Y, He J, Lee D, McCormick S. Interdependence of endomembrane trafficking and actin dynamics during polarized growth ofArabidopsispollen tubes.Plant Physiol,2010, 152(4): 2200–2210.

[62]Ischebeck T, Stenzel I, Heilmann I. Type B phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases mediateArabidopsisandNicotiana tabacumpollen tube growth by regulating apical pectin secretion.Plant Cell, 2008, 20(12): 3312–3330.

[63]Sousa E, Kost B, Malhó R.Arabidopsisphosphatidylinositol-4-monophosphate 5-kinase 4 regulates pollen tube growth and polarity by modulating membrane recycling.Plant Cell, 2008, 20(11): 3050–3064.

[64]Zhao Y, Yan A, Feijó JA, Furutani M, Takenawa T,Hwang I, Fu Y, Yang Z. Phosphoinositides regulate clathrin-dependent endocytosis at the tip of pollen tubes inArabidopsisand tobacco.Plant Cell, 2010, 22(12): 4031–4044.

[65]Pleskot R, Pejchar P, Bezvoda R, Lichtscheidl IK, Wolters-Arts M, Marc J, ?ársky V, Potocky M. Turnover of phosphatidic acid through distinct signaling pathways affects multiple aspects of pollen tube growth in tobacco.Front Plant Sci, 2012, 3: 54.

[66]Mollet JC, Leroux C, Dardelle F, Lehner A. Cell wall composition, biosynthesis and remodeling during pollen tube growth.Plants, 2013, 2(1): 107–147.

[67]Geitmann A, Steer MW. The Architecture and Properties of the Pollen Tube Cell Wall. In: Malhó R, ed. The Pollen Tube: a Cellular and Molecular Perspective. Berlin:Springer, 2006, 3: 177–200.

[68]Krichevsky A, Kozlovsky SV, Tian GW, Chen MH,Zaltsman A, Citovsky V. How pollen tubes grow.Dev Biol,2007, 303(2): 405–420.

[69]Herrmann MM, Pinto S, Kluth J, Wienand U, Lorbiecke R.The PTI1-like kinase ZmPti1a from maize (Zea maysL.)co-localizes with callose at the plasma membrane of pollen and facilitates a competitive advantage to the male gametophyte.BMC Plant Biol, 2006, 6: 22.

[70]Persia D, Cai G, Del Casino C, Faleri C, Willemse MTM,Cresti M. Sucrose synthase is associated with the cell wall of tobacco pollen tubes.Plant Physiol, 2008, 147(4):1603–1618.

[71]Verma DPS, Hong ZL. Plant callose synthase complexes.Plant Mol Biol, 2001, 47(6): 693–701.

[72]Winter H, Huber JL, Huber SC. Membrane association of sucrose synthase changes during the graviresponse and possible control by protein phosphorylation.FEBS Lett,1997, 420(2–3): 151–155.

[73]Hardin SC, Winter H, Huber SC. Phosphorylation of the amino terminus of maize sucrose synthase in relation to membrane association and enzyme activity.Plant Physiol,2004, 134(4): 1427–1438.

[74]Wang CW, Chen WC, Lin LJ, Lee CT, Tseng TH, Leu WM.OIP30, a RuvB-like DNA helicase 2, is a potential substrate for the pollen-predominant OsCPK25/26 in rice.Plant Cell Physiol, 2011, 52(9): 1641–1656.

[75]Zhou JJ, Liang Y, Niu QK, Chen LQ, Zhang XQ, Ye D.TheArabidopsisgeneral transcription factor TFIIB1 (At-TFIIB1) is required for pollen tube growth and endosperm development.J Exp Bot, 2013, 64(8): 2205–2218.

[76]op den Camp RGL, Kuhlemeier C. Phosphorylation of tobacco eukaryotic translation initiation factor 4A upon pollen tube germination.Nucleic Acids Res, 1998, 26(9):2058–2062.