李芬, 楊敬輝, 吳秀麗, 張衛(wèi)林, 王冠峰, 岳曉杰

1．河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007；

2．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，秦皇島 066003；

3．資源微生物與功能分子河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新鄉(xiāng) 453007

已知組蛋白可逆的乙?；?、甲基化修飾對(duì)基因表達(dá)具有重要影響。組蛋白甲基化多發(fā)生在賴氨酸(K)和精氨酸(R)殘基上，組蛋白K甲基化由不同的組蛋白賴氨酸特異性甲基轉(zhuǎn)移酶 (Histone lysine methyltransferases) 和賴氨酸特異性去甲基酶(Lysine-specific demethylase)共同維持，H3 的 K4、K9、K27、K36、K79和H4的K20是常見的甲基化位點(diǎn)，其氨基側(cè)鏈可發(fā)生單、二和三甲基化，發(fā)生在不同組蛋白賴氨酸的甲基化修飾可對(duì)轉(zhuǎn)錄起激活或抑制作用。

H3-K4甲基化常與基因激活相關(guān)聯(lián)。對(duì)H3-K4不同甲基化及其在不同生物體分布情況的分析顯示，該位點(diǎn)的三甲基化局限于活性轉(zhuǎn)錄基因的5′端，二甲基化則分布于這些基因的主要部分[1]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H3-K4的3種甲基化均由Set1催化，H3-K36甲基化則由 Set2負(fù)責(zé)，兩種酶均與延伸階段的RNA多聚酶Ⅱ相關(guān)聯(lián)[2]。但H3-K36的二、三甲基化都主要分布于活性轉(zhuǎn)錄基因的3′端，參與轉(zhuǎn)錄終止，是活性基因的重要標(biāo)志[3,4]。組蛋白乙?；０l(fā)生在賴氨酸殘基，有些位點(diǎn)可發(fā)生多種轉(zhuǎn)錄后修飾(如甲基化、乙?；揎椂伎砂l(fā)生在H3-K4)，且不同修飾之間還相互影響，因而使組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)的功能研究較為困難。已知H3、H4尾部多個(gè)賴氨酸突變都能引起特定的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)錄缺陷[5～7]。但對(duì)不同組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)功能的比較研究及其與特定基因激活間的認(rèn)識(shí)尚很缺乏。

為研究組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)的功能差異，豐富對(duì)“組蛋白密碼”假說的認(rèn)識(shí)，本文以釀酒酵母為材料，構(gòu)建了H3-K4、H3-K36單獨(dú)和二者共同突變?yōu)榱涟彼?L)的3種組蛋白突變株，并對(duì)其在高溫、高鹽等不同條件下的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)基因GAL1、SSA3、PHO5等的表達(dá)情況進(jìn)行比較，結(jié)果表明不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)基因表達(dá)的影響不同，其中H3-K4的修飾對(duì)于細(xì)胞快速適應(yīng)不利環(huán)境條件可能更重要。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

野生型釀酒酵母W303-1a：MATa ade2-1 ura3-1 his3-11,15，leu2-3，112 trp1-1 can1-100和缺失兩拷貝組蛋白H3/H4，由LFH菌株：MATa ade2-1 ura3-1 his3-11,15, leu2-3,112 trp1-1 can1-100, hht1-hhf1Δ::TRP1 hht2-hhf2Δ::LEU2,pRS316: HHT1-HHF1(URA3)、pUC19、pRS313質(zhì)粒。

1.2 質(zhì)粒制備、大腸桿菌轉(zhuǎn)化

參照 Sambrook等[8]的方法進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。

1.3 定點(diǎn)突變及攜帶 H3 K4L和/或 K36L突變的H3/H4拷貝1的pRS313質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

H3 K4L、K36L突變所需引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。將H3 K4L和H3 K36L的引物分別與野生型組蛋白引物H3/4S和H3/4A相匹配，以pUCHHF1-HHT1為模板，經(jīng)兩輪PCR獲得約300 bp和1100 bp兩個(gè)短片段；再以二者等摩爾混合物為模板，以H3/4S和 H3/4A為引物進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增得到含H3 K4L和K36L單突變的突變組蛋白H3/H4，將其分別克隆入pUC19并測(cè)序。以測(cè)序正確的含 H3 K4L的 pUCHHF1-hht1-K4L為模板，將H3 K36L引物分別與H3/4S和 H3/4A相匹配經(jīng)兩輪PCR獲得約300 bp和1100 bp兩個(gè)短片段，再將二者等摩爾混合物為模板，以H3/4S和 H3/4A為引物進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增，得到含H3 K4L和H3 K36L雙突變的組蛋白H3/H4，將其克隆入pUC19并測(cè)序。將測(cè)序正確的3種突變的組蛋白經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切，回收后分別亞克隆入經(jīng)同樣雙酶切的 pRS313載體，得到的陽(yáng)性克隆經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切驗(yàn)證。

1.4 酵母轉(zhuǎn)化及基因置換實(shí)驗(yàn)(Plasmid Shuffle)實(shí)驗(yàn)

酵母轉(zhuǎn)化及特定甲基化位點(diǎn)突變株制備、基因置換實(shí)驗(yàn)、組蛋白突變株篩選等參照文獻(xiàn)[9～12]。

1.5 PCR鑒定3種組蛋白突變株

已知 pRS313 攜帶長(zhǎng)度為 657 bp 的HIS3 基因，pRS316攜帶長(zhǎng)度為801 bp的URA3基因，針對(duì)其序列設(shè)計(jì)引物，序列見表1。采用菌落PCR法鑒定突變株，挑取新鮮轉(zhuǎn)化株單菌落(直徑＞ 2 mm)，在15 μL 2%SDS中渦旋15 s充分混勻，90℃ 孵育4 min，離心1 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增體系為50 μL：10 ×PCR Buffer 5.0 μL，50 mmol/ L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，25% Triton X-100 2 μL，引物 10 μmol/L各 0.5 μL，Taq酶 0.5 μL，上述 DNA 粗提液 1 μL ，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，53℃變性1 min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物序列

1.6 突變株表型檢測(cè)

參照李芬等[11,12]的方法，取鑒定正確的各組蛋白突變株和對(duì)照單菌落接種于適量培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 過夜后計(jì)數(shù)并調(diào)整各樣品至同一濃度，對(duì)各菌株均作5個(gè)濃度梯度稀釋，分別接種10 000，2000、400 、80 、16 個(gè)細(xì)胞于配制好的各種平板上，于 30℃和 39℃培養(yǎng)并觀察各菌株生長(zhǎng)，在 2 d、4 d 時(shí)拍照。

1.7 GAL1、PHO5和SSA3的誘導(dǎo)表達(dá)

GAL1、SSA3誘導(dǎo)表達(dá)主要參照李芬等[11,12]的方法。PHO5的誘導(dǎo)：在SD培養(yǎng)基中接種待測(cè)菌株，30℃、200 r/min培養(yǎng)至指數(shù)中期即OD值約1.0，取適量培養(yǎng)物作對(duì)照，剩余轉(zhuǎn)入低磷培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別于90 min、180 min取樣，提取總RNA。

1.8 RNA的提取、RT-PCR和Real-time PCR

RNA提取采用熱酸性酚法[13]。分別取 1 μg總RNA，依照試劑盒說明書42℃ 反轉(zhuǎn)錄1 h，取1/25 cDNA做為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)引物的特異性。擴(kuò)增體系：Primix EX 25 μL，2 μmol / L 引物各 5 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至 50 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 3 min；94℃1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；最后再72℃ 5 min。定量 PCR 采用 SYBR Green (TaKaRa,Osaka, Japan) 熒光染料法依照說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：SYBR Green Real-time PCR Master mix 12.5 μL，5 μmol/L 引物各 1 μL，模板 2 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。 擴(kuò)增條件：95℃ 1 min，然后 95℃ 15 s和60℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增GAL1、SSA3和ACT1基因的引物序列見李芬等[11,12]方法；擴(kuò)增PHO5基因的引物序列見表1。上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，ACT1為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果[13,14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 攜帶H3 K4L或/和K36L突變的H3/H4拷貝1的pRS313質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以pUCHHF1-HHT1為模板，經(jīng)三輪PCR擴(kuò)增獲得含H3 K4L和K36L單突變的H3/H4全長(zhǎng)序列。各PCR產(chǎn)物均與預(yù)期吻合，無(wú)非特異擴(kuò)增現(xiàn)象。將其分別克隆入pUC19，酶切鑒定正確(圖1A)，測(cè)序無(wú)突變；以測(cè)序正確的含H3 K4L的pUCHHF1-hht1-K4L為模板，經(jīng)3輪PCR擴(kuò)增獲得含H3 K4L/K36L雙突變H3/H4全長(zhǎng)序列，將其克隆入pUC19測(cè)序；酶切鑒定正確(圖1C)，3種突變拷貝測(cè)序結(jié)果表明，除引入的K4L和K36L外無(wú)其他突變(測(cè)序結(jié)果及比對(duì)略)。含 3種突變 H3/H4全長(zhǎng)的 pUC19質(zhì)粒經(jīng)EcoR I/XbaI雙酶切，回收后分別克隆入經(jīng)上述兩種酶消化的 pRS313載體，得到的陽(yáng)性克隆經(jīng)EcoR I/XbaI雙酶切驗(yàn)證正確(圖1：B和D )。

2.2 3個(gè)組蛋白特定甲基化位點(diǎn)突變菌株的獲得及鑒定

采用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法將分別攜帶突變 H3/H4的PRS313 質(zhì)粒：pRS313 K4L、pRS313 K36L、pRS313 K4L/K36L分別轉(zhuǎn)化LFH菌株，轉(zhuǎn)化液涂SD/-His/+5-FOA平板，已知該菌株基因組H3/H4缺失，其生存所必需的組蛋白H3/H4 由攜帶野生H3/H4拷貝1和URA3篩選標(biāo)記的 pRS316 提供，當(dāng)培養(yǎng)基中添加5-FOA 時(shí)，含pRS316質(zhì)粒提供野生H3/H4 的細(xì)胞會(huì)因表達(dá)URA3而死亡，丟失上述質(zhì)粒未轉(zhuǎn)入突變拷貝的細(xì)胞會(huì)因缺乏必需的H3/H4而死亡，只有該質(zhì)粒被含突變H3/H4和HIS3標(biāo)記的pRS313質(zhì)粒替換的細(xì)胞方可存活。故利用SD/-His/+5-FOA篩選可獲得H3-K4、H3-K36和二者共同突變?yōu)榱涟彼岬腟4、S36和D436菌株。

以HIS3特異引物進(jìn)行菌落 PCR 結(jié)果顯示，得到與預(yù)期相符的582 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)，而URA3特異引物的PCR除對(duì)照得到預(yù)期的437 bp產(chǎn)物外，在3突變株中均無(wú)擴(kuò)增條帶；用抗H3-K4 3種甲基化和乙?；贵w對(duì) H3-K4 (S4) 突變株進(jìn)行的免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明突變株該位點(diǎn)的甲基化和乙?；揎梿适В砻鞯拇_得到了正確的突變株。

圖1 攜帶H3 K4L或/和K36L突變H3/H4拷貝1的pRS313質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

圖2 組蛋白突變株的鑒定

2.3 S4、S36和D436菌株與野生型的表型比較

為研究H3-K4和K36兩重要位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄后修飾喪失對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響，將單突變株S4、S36和雙突變株 D436與野生型(WT)在不同條件下的表型進(jìn)行比較(圖3)。由圖3可以看出，3種組蛋白突變株的生長(zhǎng)情況均不如野生型，其中雙突變株D436生長(zhǎng)最慢，高溫、高鹽條件下單突變株S4比S36稍慢，表明組蛋白H3-4K和36K的轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)細(xì)胞維持正常生存非常重要。在對(duì)高溫、高鹽等不利環(huán)境條件的快速適應(yīng)方面，H3-K4的修飾比H3-36K更重要。

圖3 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

2.4 S4、S36和 D436菌株與野生型 GAL1基因表達(dá)的比較

因半乳糖為單一碳源時(shí)，雙突變株生長(zhǎng)明顯較慢，可能是因?yàn)镠3-K4和H3-K36同時(shí)突變影響了GAL基因的表達(dá)。本研究以 W303為對(duì)照，對(duì) S4、S36 和 D436 菌株的GAL1基因表達(dá)進(jìn)行了RT-PCR(圖 4A)和 qRT-PCR檢測(cè)(圖 4B)。由圖 4A 可知，PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期相符的特異性條帶，qRT-PCR結(jié)果顯示：未誘導(dǎo)時(shí)，各菌株GAL1基因的表達(dá)水平接近甚至趨于零，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)該基因的表達(dá)均緩慢上升，但不同菌株上升速度明顯不同；各突變株顯著低于野生型(P＜0.01)，表明組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變影響了GAL1表達(dá)；雙突變株D436的GAL1表達(dá)明顯比單突變株S4、S36低(P＜0.05)，而單突變株 S4低于 S36(P＜0.05)。表明上述兩位點(diǎn)突變使GAL1激活延遲，突變株在半乳糖為單一碳源時(shí)的表型缺陷是因該條件下細(xì)胞生存所必需的GAL基因激活延遲所致。

2.5 S4、S36和D436菌株與野生型SSA3基因表達(dá)的比較

因雙突變株對(duì)高溫敏感，可能因組蛋白突變影響了熱激蛋白基因的表達(dá)。本研究以野生型為對(duì)照，對(duì)3種組蛋白突變株的SSA3表達(dá)進(jìn)行了RT-PCR(圖5A)和 qRT-PCR檢測(cè)(圖 5B)。圖 5A表明，PCR擴(kuò)增獲得了與預(yù)期相符的特異性條帶。qRT-PCR結(jié)果顯示：未熱激時(shí)各菌株SSA3都有基礎(chǔ)水平的表達(dá)，熱激10 min后，其SSA3表達(dá)均有顯著升高(10 min與 0 min相比較：WT、S36、S4：P＜0.0001； D436：P＜0.05)，隨熱激時(shí)間延長(zhǎng)各菌株SSA3表達(dá)呈下降趨勢(shì)(30 min同10 min相比較：P＞0.05)，但不同菌株SSA3表達(dá)下降速率明顯不同。其中組蛋白突變株SSA3表達(dá)均顯著低于野生型對(duì)照，以雙突變株D436最為明顯(WT 同D436相比較：P＜0.001；WT vs S4或S36：P＜0.05)。單突變株S36與S4差別不大(P＞0.05)。表明上述兩位點(diǎn)突變可延遲SSA3激活，組蛋白雙突變株的高溫敏感表型是因該條件下細(xì)胞生存所必需的Hsp基因激活延遲所致。

圖4 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變對(duì)釀酒酵母GAL1基因表達(dá)的影響

2.6 S4、S36和D436菌株與野生型PHO5基因表達(dá)的比較

低磷條件可誘導(dǎo)酵母PHO5基因表達(dá)。為檢測(cè)組蛋白兩位點(diǎn)突變可造成誘導(dǎo)基因激活延遲，本研究以ACT1為內(nèi)參，對(duì)3突變株誘導(dǎo)基因PHO5進(jìn)行 RT-PCR(圖 6A)和 qRT-PCR(圖 6B)分析。qRT-PCR結(jié)果表明，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)各菌株該基因的表達(dá)均緩慢上升，但不同菌株上升速率明顯不同；組蛋白突變株的該基因表達(dá)顯著低于野生型對(duì)照(WT同 S4或 S36相比較：P＜0.05)，其中以組蛋白雙突變株D436最為明顯(WT 同D436相比較:P＜0.01)，表明兩位點(diǎn)突變也顯著延遲了誘導(dǎo)基因PHO5的激活。

圖5 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變對(duì)釀酒酵母SSA3基因表達(dá)的影響

圖6 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變對(duì)釀酒酵母PHO5基因表達(dá)的影響

3 討 論

發(fā)生在組蛋白特定氨基酸殘基的乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化等修飾對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性有重要影響，通過影響組蛋白之間、組蛋白與DNA之間的相互作用而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。而且單一的組蛋白修飾常不能單獨(dú)起作用，一種修飾常?？梢种苹蛑笇?dǎo)另一修飾的存在，形成不同組蛋白修飾的級(jí)聯(lián)，而同時(shí)存在于組蛋白不同位點(diǎn)的多種修飾則作為一種語(yǔ)言或標(biāo)志即“組蛋白密碼”被細(xì)胞內(nèi)多種非組蛋白所識(shí)別，并以此決定基因的表達(dá)，組蛋白密碼的存在大大豐富了傳統(tǒng)遺傳密碼的信息含量[4,15]。

為研究H3-K4和H3-K36兩位點(diǎn)功能的差異，豐富對(duì)組蛋白密碼假說的認(rèn)識(shí)，本文以釀酒酵母為材料，構(gòu)建了兩位點(diǎn)可能存在的3種形式突變株即：4、36位單突變及兩位點(diǎn)同時(shí)突變，并比較了高溫、高鹽等條件下突變株的生長(zhǎng)及PHO5、SSA3和GAL1表達(dá)情況，結(jié)果表明：同野生型相比，供試條件下各突變株的生長(zhǎng)及幾個(gè)誘導(dǎo)基因的激活均有不同程度的減慢，雙突變株D436缺陷表型最嚴(yán)重。表明組蛋白H3-K4和H3-K36的轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和適應(yīng)不利環(huán)境條件極為重要。

同本實(shí)驗(yàn)室先前對(duì) H3-K14 和 H4-K8 兩乙酰化位點(diǎn)突變株的研究結(jié)果類似[12]，單突變株S4和S36在半乳糖為單一碳源、30℃條件下無(wú)明顯差別，但其GAL1激活則有顯著差異(P＜0.05)。可能因?yàn)榻M蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變僅使某些誘導(dǎo)基因的激活延遲，并非關(guān)閉，因組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾功能重疊的影響，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)基因經(jīng)由其他途徑被激活表達(dá)，從而使缺陷表型得到逐步緩解。細(xì)胞之所以能夠在高溫等不利條件下生存生長(zhǎng)，是因能激活相應(yīng)條件下細(xì)胞生存所必需的基因進(jìn)行表達(dá)[12]，故單突變株S4和S36在不同環(huán)境中的差異表型表明同一位點(diǎn)的修飾對(duì)不同基因的轉(zhuǎn)錄激活影響不同，H3-K4的修飾對(duì)于細(xì)胞快速適應(yīng)高溫等不利條件可能比H3-K36更重要。

組蛋白乙?；稽c(diǎn) H3-K14和 H4-K8突變的3種突變株表型與本文的突變株表型及GAL1激活延遲均非常類似，只是程度不同[12]，因此本研究認(rèn)為該現(xiàn)象的產(chǎn)生是因組蛋白乙?；⒓谆揎椣嚓P(guān)聯(lián)所致。已知人類Mll基因與許多不同種類的白血病的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，包括 AML(Acute myeloid leukemia)，Mll基因編碼的蛋白有特異的 H3-K4甲基轉(zhuǎn)移酶活性，H3的乙?；纱龠M(jìn)其活性增加[16]。酵母中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set1和Set2分別催化H3-K4和 H3-K36的甲基化[17]，作為 NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和 Rpd3組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物組分的Eaf3可識(shí)別基因5′端甲基化的H3-K4和H3-K36[18]。其中H3-K36的甲基化除了提供Rpd3S對(duì)轉(zhuǎn)錄基因編碼區(qū)的去乙?；盘?hào)外[19,20]，還通過抑制組蛋白伴侶分子的作用而阻止乙酰化的組蛋白摻入轉(zhuǎn)錄基因的編碼區(qū)[21]，以去除轉(zhuǎn)錄延伸相關(guān)的乙酰化從而抑制基因內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始，保證 RNAPII轉(zhuǎn)錄的精確性。Morillon等發(fā)現(xiàn)H3-K4和H3-K36的甲基化與特定基因(Met16和Rrs11B)5'端Esa1 (組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物NuA4的催化亞基)依賴的H4的乙?；嚓P(guān)[19]，而Esa1可通過克服染色質(zhì)的抑制狀態(tài)而促進(jìn)PHO5的轉(zhuǎn)錄[22]。 由此可見3個(gè)組蛋白突變株的表型缺陷和GAL1，SSA3及PHO5等誘導(dǎo)基因表達(dá)延遲缺陷可能是因?yàn)榻M蛋白上述轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)突變，不僅造成了該位點(diǎn)甲基化、乙?；刃揎椀膯适В赡芤灿绊懥似渌稽c(diǎn)的乙?；M(jìn)而改變了組蛋白密碼，延遲該條件下細(xì)胞生存所必需的基因的激活導(dǎo)致的。

Carvin等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Set1 缺失可導(dǎo)致PHO5和GAL1-10表達(dá)升高，該結(jié)果與本文H3 K4L突變引起的結(jié)果正好相反。我們認(rèn)為該差異的產(chǎn)生可能是由于 Set1缺失僅影響 H3-K4的甲基化修飾，而H3 K4L突變則造成該位點(diǎn)各種轉(zhuǎn)錄后修飾的喪失(圖2B)；已知酵母中主要由Set1催化的H3-K4的甲基化修飾僅占H3總量大約34%[24]，剩余的H3-K4還可發(fā)生乙?；绒D(zhuǎn)錄后修飾；故嚴(yán)格說S4的表型實(shí)際上是H3-K4突變?cè)斐稍撐稽c(diǎn)轉(zhuǎn)錄后修飾喪失的綜合效應(yīng)，而非僅由突變位點(diǎn)甲基化喪失引起的效應(yīng)，這也再次體現(xiàn)了組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾功能的復(fù)雜性。Ucar 等[25]運(yùn)用 CoSBI(Cohernt and shifted bicluster identification)算法，在人 CD4+ T 細(xì)胞全基因組范圍確定了包含 19 種轉(zhuǎn)錄后修飾的 873 種組蛋白修飾組合模式，其中 50% 以上的組合模式包含了H2BK5Ac、H4K8Ac、H2BK120Ac、H3K9Ac、3K18Ac、H3K27 Ac、H4K5Ac、H3K4Ac、H3K36Ac 和H3K4me3等10種修飾。Venkatatesh 等[21]對(duì)正常和Set2 缺失酵母菌株 6000 個(gè)基因的全部甲基化和乙?；V進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中，Set2 植入的抑制性甲基化標(biāo)記(H3K36me)位于活躍轉(zhuǎn)錄的基因兩側(cè)，但在Set2 缺失突變株中，這些標(biāo)記喪失，大部分基因的乙?；瘶?biāo)記反而比正常細(xì)胞增加。由此可見，組蛋白某個(gè)位點(diǎn)突變除造成該位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄后修飾的喪失外，也影響其他位點(diǎn)的修飾，導(dǎo)致基因組組蛋白修飾模式改變，引發(fā)不同基因表達(dá)變化，最終影響表型。雙突變株D436缺陷表型之所以更為嚴(yán)重，是因?yàn)镠3-K4和H3-K36同時(shí)突變，兩位點(diǎn)的乙?；图谆揎梿适?，引發(fā)基因組組蛋白修飾模式發(fā)生比單突變更大的改變，從而影響更多基因的表達(dá)，導(dǎo)致它對(duì)各不利條件更敏感。正因?yàn)橥瑫r(shí)存在于組蛋白不同位點(diǎn)的多種修飾以組合模式的形式起作用，因此很難確定上述位點(diǎn)的乙?；图谆揎椀降啄姆N與突變體的表型直接相關(guān)，本文的組蛋白突變株的缺陷表型嚴(yán)格上應(yīng)是相應(yīng)位點(diǎn)突變導(dǎo)致多種修飾改變而引發(fā)組蛋白修飾模式改變所造成的綜合影響。

日益增多的證據(jù)表明組蛋白乙?；⒓谆绒D(zhuǎn)錄后修飾不僅影響基因的表達(dá)，還與包括癌癥等在內(nèi)的多種人類重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此對(duì)不同組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)的功能差異進(jìn)行深入的比較研究，不僅可以豐富并加深對(duì)組蛋白修飾功能和“組蛋白密碼假說”的認(rèn)識(shí)，對(duì)于某些因組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾異常引起的人類重大疾病發(fā)病機(jī)理的揭示和治療均至關(guān)重要。

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