王躍力，葉峻杰，李宗芳，鄭水，馬麗，郭海，楊麗娟，程寶文

1. 成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院，昆明 650032；

2. 云南省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所司法鑒定中心，云南省生育調(diào)節(jié)與少數(shù)民族優(yōu)生重點實驗室，昆明650021；

3. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650021；

4. 云南省公安廳，昆明650228

2. Key Laboratory for Fertility Regulation and Birth Health of Minority Nationalities of Yunnan Province, Judicial Expertise Centre, Yunnan Population and Family Planning Research Institute, Kunming 650021, China;

3. TheFirst Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650021, China;

4. Department of Public Security of Yunnan Province, Kunming 650228, China

人類Y染色體短串聯(lián)重復(fù)(Y-short tandem repeat,Y-STR)作為一個特殊的遺傳標(biāo)記以其獨特的優(yōu)勢在法醫(yī)個體識別和家系研究中發(fā)揮著重要作用。目前已經(jīng)報道并命名的 Y-STR位點已經(jīng)達到 300多個，SWGDAM(The US Scientific Working Group on DNA Analysis Methods) 發(fā)布的 11個“核心”STR基因座[1]被廣泛應(yīng)用在男性個體識別的商業(yè)化試劑盒中。除此之外，為了增強Y-STR的鑒別能力，單拷貝基因座DYS549和兩個雙拷貝基因座DYS527、DYS459已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定[2]。在男性不育患者中，Y染色體無精癥因子區(qū)域(Azoospermia factor，AZF)存在較高的微缺失發(fā)生率。位于AZF區(qū)的DYS549、DYS527、DYS459基因座在男性不育人群中很有可能表現(xiàn)出等位基因缺失或重復(fù)的特殊基因型，DNA檢驗人員無法判斷特殊基因型是由于實驗結(jié)果偏差(樣本DNA降解或擴增失敗)還是實驗對象本身遺傳多態(tài)造成的。因此，這些特殊基因型會對應(yīng)用Y-STR進行個體識別的結(jié)果產(chǎn)生干擾。DYS549位于AZFb區(qū)域(sY108-sY135)，在Y染色體上的物理位置為19.98 Mb；兩個雙拷貝基因座DYS527、DYS459位于AZFc區(qū)域(sY142-sY1201)，在 Y染色體上的物理位置分別為24.29 Mb(反向位置：26.49 Mb)和24.49 Mb(反向位置：26.29 Mb)(3個基因座的資料可以在 UCSC Genome Browser基因組數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)中查到)。本研究應(yīng)用 14 Y-STR的復(fù)合擴增體系(DYS481、DYS576、DYS570、DYS527、DYS459、DYS549、DYS444、DYS449、DYS508、DYS552、DYS522、DYS446、DYS607和DYS627)對無精癥和嚴重少精的男性不育人群進行掃描，研究位于AZFb區(qū)的DYS549和AZFc區(qū)的DYS527、DYS459的多態(tài)性；應(yīng)用STS位點確認AZFa、AZFb、AZFc片段的缺失和DAZ、CDY1基因拷貝數(shù)檢測來確認AZFc區(qū)片段的缺失和部分重復(fù)，由此確認男性不育人群中特殊基因型的存在。

1 材料和方法

1.1 實驗樣本

非梗阻性無精癥、嚴重少精子癥(精子濃度：＜5×106/mL)患者236例，先天性雙側(cè)輸精管缺如患者4例，共 240例男性不育癥患者外周抗凝血標(biāo)本。病例篩選標(biāo)準為[3]：男性學(xué)和實驗室檢查排除促性腺激素不足性性腺功能減退癥；細胞染色體核型正常；排除再發(fā)感染性梗阻性無精癥和嚴重少精子癥。在病理篩查過程中，精液常規(guī)檢測采用世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊(WHO，1999)[4]標(biāo)準。所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用 QIAamp?DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden,Germany)微量DNA提取試劑盒，按照說明書提取基因組DNA。

1.2.2 AZF微缺失的STS檢測

根據(jù)《歐洲Y染色體微缺失分子診斷指南2004版本》推薦的AZF微缺失STS位點[5]，選取6個STS位點(AZFa：sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc：sY254、sY255)進行AZF缺失分析。以Y染色體性別決定基因(Sex-determining region on the Y chromosome,SRY)為男性內(nèi)對照，正常男性DNA為陽性對照，正常女性DNA為陰性對照，去離子水為空白對照，采用本實驗室建立的改良多重 PCR技術(shù)[6]對樣本全基因組DNA進行擴增。擴增反應(yīng)分為兩組：A組擴增SRY、sY254、sY127和sY86標(biāo)記所在 DNA片段；B組擴增 SRY、sY134、sY84和sY255標(biāo)記所在DNA片段。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng) 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測AZF不同的缺失類型。引物序列及反應(yīng)條件參考文獻[6]。

1.2.3 QF-PCR擴增

14個Y-STR基因座的引物設(shè)計和多重PCR反應(yīng)體系參照 Hanson的方法進行[2]，熒光引物由Invitrogen公司合成。反應(yīng)體系的總體積為 10 μL，包括：PCR Reaction Mix 4 μL，Primer Set 2 μL，GoldTaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL，模板 DNA 0.5～l ng，去離子水補足。反應(yīng)條件：95℃ 11 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，28 個循環(huán)；60℃ 60 min。PCR產(chǎn)物在ABI 310遺傳分析儀上進行毛細管電泳，應(yīng)用 ABI GeneScan?-500 LIZ?size standard (Applied Biosystems)做為內(nèi)參標(biāo)準，GenemapperID V3.2軟件收集數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。

1.2.4 DAZ、CDY1基因拷貝數(shù)的檢測

以DAZL基因(位于常染色體的DAZ同源基因，2個拷貝)作為內(nèi)參基因，使用引物 o1130(5'-ttaagtactactgtagacac-3')和o1313(5'-gtttcttgtataatgtagaagagtagagc-3')[7]擴增DAZ(214 bp)和DAZL(217 bp)基因；以CDY2基因(位于Y染色體的CDY1同源基因，2個拷貝)作為內(nèi)參基因，使用引物 o953a(5'-tattgagacccttgcacctg-3')和o1023(5'-gtttcttggagtttcccttctgtcacc-3')[7]擴增CDY1(134 bp)和CDY2(137 bp)基因。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 40 s，28 個循環(huán)；60℃ 60 min。o1130和o953a引物的5'端標(biāo)記FAM熒光，PCR產(chǎn)物在ABI 310遺傳分析儀上進行毛細管電泳，應(yīng)用ABI GeneScan?- 500 LIZ?size standard (Applied Biosystems)作為內(nèi)參標(biāo)準，DAZ和CDY1的基因拷貝數(shù)分別通過與DAZL和CDY2峰面積的大小比較來確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y染色體微缺失

圖1 AZF微缺失多重PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

對 236例非梗阻性無精癥、嚴重少精子癥和 4例先天性輸精管缺失患者的6個STS位點進行檢測，共發(fā)現(xiàn)40例AZF缺失，缺失比例為16.67%。其中2例AZFa缺失，缺失比例為5%；2例AZFb缺失，缺失比例為5%；30例AZFc缺失，缺失比例為75%；AZFb+c的缺失類型有6例，缺失比例為15%?？紤]其患病類型，非梗阻性無精癥患者存在13例AZFc缺失、6例AZFb+c缺失、2例AZFa缺失和1例AZFb缺失；嚴重少精子癥患者存在 17例AZFc缺失、1例AZFb缺失；先天性輸精管缺如患者未發(fā)現(xiàn)AZF缺失。AZF微缺失的STS檢測瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.2 14 Y-STR體系等位基因缺失

掃描14 Y-STR基因座發(fā)現(xiàn)38例STR位點出現(xiàn)缺失，AZFc缺失類型發(fā)現(xiàn)DYS527、DYS459缺失，AZFb+c缺失類型發(fā)現(xiàn)DYS549、DYS527、DYS459缺失，2例AZFb缺失類型區(qū)域內(nèi)缺失DYS549，2例AZFa缺失和 4例先天性輸精管缺如患者未發(fā)現(xiàn)STR位點缺失(表 1)。AZFb+c微缺失病例的基因分型結(jié)果見圖2。除了DYS549、DYS527、DYS459外，其他位點在男性不育人群中未見缺失。

2.3 DAZ、CDY1基因拷貝數(shù)

位于AZFc區(qū)的DAZ/CDY1基因正?？截悢?shù)為4/2。應(yīng)用基因拷貝數(shù)檢測可以證實不育癥患者中AZFc區(qū)Y-STR位點的缺失和復(fù)制(表1)。本研究發(fā)現(xiàn)，36例AZFc缺失和AZFb+c的患者DAZ/CDY1基因拷貝數(shù)為0/0，與DYS527、DYS459缺失結(jié)果相符；10例AZFc部分片段復(fù)制的患者DAZ/CDY1基因拷貝數(shù)為 6/3，占所調(diào)查不育人群的 4.17%。14個Y-STR基因座篩查電泳圖譜(圖3)顯示DYS527、DYS459各為3個拷貝。

表1 Y-STR基因座在不育患者中的缺失/重復(fù)類型

圖2 AZFb+c缺失的14 Y-STR基因座電泳結(jié)果

圖 3 男性不育病例中 DYS459、DYS527拷貝數(shù)重復(fù)的電泳結(jié)果

3 討 論

作為人類僅有的單倍遺傳的染色體，Y染色體的非重組區(qū)(No-recombining region of the Y, NRY)存在著大量高度同源的重復(fù)序列，其頻發(fā)的染色體內(nèi)非等位性重組(Non-allelic homologous recombination, NAHR)使Y染色體具備了高變異率的特點，導(dǎo)致 Y染色體出現(xiàn)缺失、重復(fù)等結(jié)構(gòu)上的變化[8,9]。Vogt等[10]將AZF區(qū)域劃分為3個互相隔離的亞區(qū)，分別為AZFa、AZFb和AZFc，Y染色體長臂與精子發(fā)生相關(guān)的AZF區(qū)微缺失可以造成生精障礙，是造成男性不育的原因之一，不同區(qū)域的AZF缺失對應(yīng)不同的臨床不育表型如無精和嚴重少精癥。約1/4000的男性因AZFc缺失而導(dǎo)致不育[11]；AZFa缺失則很少見，其發(fā)生率約為1/100 000[9]；AZFb在人群中的缺失頻率介于AZFc和AZFa之間[11]。在本文所調(diào)查的不育人群中，AZFc、AZFb、AZFb+c、AZFa缺失比率分別為75%、5%、15%、5%，與付莉等[12]報道的中國人群AZF缺失比率相近，而與白種人的缺失類型之間存在差異[13]。AZFc區(qū)部分重復(fù)在臺灣漢族和云南彝族人群中與男性不育相關(guān)[14,15]，這些男性的臨床表型表現(xiàn)為無精癥或嚴重少精癥。

由于Y染色體的NRY區(qū)不與X染色體核酸結(jié)構(gòu)在減數(shù)分裂中發(fā)生重組，除了基因突變以外，其序列在父性家系中能夠穩(wěn)定地一代又一代傳遞下去，因此在法醫(yī)學(xué)上Y-STR在個體識別中的鑒別能力決定于構(gòu)成單體型的 Y-STR基因座數(shù)量，應(yīng)用的Y-STR基因座數(shù)量越多，鑒別效能越高。自20世紀90年代以來，商業(yè)化Y-STR應(yīng)用到法醫(yī)鑒定的數(shù)量已經(jīng)從9個發(fā)展到17個基因座[16]。本文應(yīng)用的14個Y-STR位點是17個商業(yè)化Y-STR基因座以外的補充。同時，在男性個體識別的檢驗中已發(fā)現(xiàn)兩個無關(guān)個體的17個商業(yè)化Y-STR基因座同時匹配現(xiàn)象，因此篩選更多的Y-STR基因座，提高單體型鑒別效能，是法醫(yī)學(xué)的一個研究熱點。在家系分析中，14個Y-STR中的單拷貝基因座DYS549在北京漢族和潮汕漢族群體中的基因多樣性(Gene diversity，GD)為0.63、0.64[17,18]；雙拷貝基因座DYS527在廣東漢族中的GD為0.92[19]；另一個雙拷貝基因座DYS459在武漢漢族中的GD為0.6[20]；美國人群DYS549、DYS527、DYS459的 GD 為 0.72、0.92、0.75[2]。這些數(shù)據(jù)說明3個基因座在人類學(xué)研究中具有相當(dāng)高的應(yīng)用價值。

本課題組在前期研究中，采用商業(yè)化的 17個Y-STR基因座 Y-filerTM試劑盒(DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS385a/b、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y-GATA-H4)對無精和嚴重少精的男性不育人群進行了掃描，在 8個Y-STR基因座發(fā)現(xiàn)無效等位基因，其中AZFa缺失的病例發(fā)現(xiàn)DYS438、DYS439、DYS437、DYS389I和DYS389II等位基因缺失；AZFb缺失的病例發(fā)現(xiàn)DYS392、DYS385a/b等位基因缺失；AZFc缺失的病例發(fā)現(xiàn)DYS448等位基因缺失[21]。本研究結(jié)果顯示，位于AZFb區(qū)的DYS549和AZFc區(qū)的DYS527、DYS459表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)多態(tài)性，同樣表現(xiàn)為因男性不育個體 Y染色體微缺失導(dǎo)致的無效等位基因現(xiàn)象[18]。AZFc和AZFb區(qū)(包括AZFb+c)在中國Y染色體微缺失人群中缺失比率較大，如果男性當(dāng)事者是由于遺傳缺陷導(dǎo)致的無精癥和嚴重少精癥患者時，應(yīng)用DYS549、DYS527和DYS459進行法醫(yī)學(xué)或家系分析可能會碰到困難的解釋問題。DAZ/CDY1基因拷貝數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)DYS527、DYS459兩個雙拷貝基因為多拷貝變化。一方面DAZ/CDY1基因拷貝數(shù)為0驗證了DYS527、DYS459無效等位基因的存在，另一方面DAZ/CDY1基因的多拷貝及3個樣本特殊的基因型(圖3)證明了DYS527、DYS459基因重復(fù)，這些變化是由于AZFc區(qū)再發(fā)的染色體重組形成的而不是實驗偏差。AZFc部分復(fù)制的發(fā)生頻率因不同的種族背景而不同，其作為一種有效的工具應(yīng)用父系和人類進化的研究[22]。但這種多態(tài)性會給法醫(yī) DNA檢驗的判讀增加難度。本研究發(fā)現(xiàn)3個Y-STR基因座在男性不育人群中存在特殊基因型，對個體識別和家系分析中出現(xiàn)的 DNA檢驗異常結(jié)果提供了合理的解釋。

由于AZFc缺失的臨床表型呈多樣化，常見于無精和嚴重少精癥患者，也可見于精子數(shù)量正常的男性[9]，并且文獻報道AZFc完全缺失的嚴重少精癥患者也可能生育后代[21]，所以當(dāng)Y-STR檢驗出現(xiàn)異常基因型時，鑒定者應(yīng)考慮當(dāng)事人的生殖實驗參數(shù)。最新的23個Y-STR位點試劑盒仍然包含DYS549[16]，King等[11]建議商業(yè)化法醫(yī)學(xué)試劑盒的設(shè)計盡量避開AZF區(qū)，以避免因臨床不育癥涉及到的DNA實驗問題。由于男性不育癥相關(guān)的Y-STR多態(tài)性會給法醫(yī) DNA檢驗的判讀增加難度，本研究闡明DYS549、DYS527和DYS459在男性不育人群中的異質(zhì)性，在法醫(yī) DNA鑒定中可以更好地完善 Y-STR數(shù)據(jù)庫和提高STR數(shù)據(jù)的解釋能力。在家系分析中，Y-STR基因座的選擇同樣要避開AZF區(qū)，避免因遺傳病涉及到的個人隱私問題。

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