宋曉燕，張德祥，張文武，季從亮，張細(xì)權(quán)，羅慶斌

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；

2. 廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，新興 527439；

3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642

夏季高溫引起雞(Gallus gallus)的熱應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致雞生理機(jī)能改變、繁殖性能下降，嚴(yán)重影響雞的肉、蛋產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量，給養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來巨大的損失[1～3]。雞在熱應(yīng)激時的生理生化特性已有報(bào)道，例如：熱應(yīng)激影響雞生理過程的改變，增加雞空腸內(nèi)頂端葡萄糖的轉(zhuǎn)換[4]；誘導(dǎo)雞骨骼肌中超氧游離基產(chǎn)生[5]；影響雞頸動脈上皮鈣離子通道的改變[6]；對肝臟線粒體呼吸作用、活性氧族的產(chǎn)生和脂質(zhì)氧化反應(yīng)具有顯著影響[7]；影響血液中T3、CD3、CD4/CD8、H/L(異嗜性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞)值、皮質(zhì)酮等[8～11]；急性熱應(yīng)激會影響肉雞的采食[12]。此外，研究表明熱應(yīng)激還會影響肉雞鈣離子濃度的變化、細(xì)胞的增殖、白細(xì)胞介素-2的產(chǎn)生[13]。對雞的耐熱性與熱休克蛋白(Heat shock proteins , HSPs)家族基因的關(guān)系也有報(bào)道，熱應(yīng)激條件下HSP70和HSP90表達(dá)量升高，有利于雞抵抗熱應(yīng)激損傷[14～17]。相關(guān)研究利用基因芯片技術(shù)分析了果蠅(Drosophila melanogaster)、小鼠(Mus musculus)、家豬(Sus domesticus)等模式動物熱應(yīng)激相關(guān)基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同物種各具特點(diǎn)[18～23]。熱應(yīng)激是受多基因影響和調(diào)控的復(fù)雜生理過程，在雞中，對于影響和調(diào)控這一復(fù)雜生理過程的分子機(jī)制還缺乏系統(tǒng)的研究。本文旨在利用全基因組表達(dá)譜芯片檢測雞熱應(yīng)激相關(guān)的差異表達(dá)基因，結(jié)合生物信息學(xué)方法分析熱應(yīng)激影響雞重要生理功能的分子機(jī)制，為篩選雞耐熱性候選基因提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

由廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司提供矮小型黃羽肉雞純系雛雞24只(公母各半)。常規(guī)飼養(yǎng)8 d，分為2組，每組12只(公母各半)，以28℃±1℃處理3 h為對照組，40℃±1℃應(yīng)激3 h為實(shí)驗(yàn)組。3 h后，立即處死參試雛雞，采集大腦、肝臟、腿肌組織，放入液氮保存，后轉(zhuǎn)入–80℃冰箱保存，用于提取RNA。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和RNA池的構(gòu)建

采用 Trizol(Invitrogen)一步法提取各組織的總RNA。異丙醇沉淀法濃縮RNA后進(jìn)一步采用Qiagen RNeasy Mini Kit進(jìn)行總RNA樣品的純化。RNA樣品的純度采用紫外分光光度計(jì)(ND-1000)測定并計(jì)算，OD260/280在1.8～2.0之間。RNA樣品的完整性采用甲醛變性膠凝電泳檢測，28S和18S rRNA比值在2.0以上。將特定組織的公、母各1個樣品進(jìn)行等量混合，獲得1個樣品RNA池，熱應(yīng)激處理組和對照組各制備3個RNA池。

1.2.2 微陣列分析

本研究選用Affymetrix GeneChip Chicken Genome Array芯片，該芯片包含了38 535個探針組，代表雞的32 773個轉(zhuǎn)錄本。實(shí)驗(yàn)在博奧生物集團(tuán)有限公司進(jìn)行，芯片及探針的詳細(xì)信息可參見Affymetrix公司網(wǎng)站(http://www.Affymetrix.com)，具體實(shí)驗(yàn)過程參見 GeneChip Expression Analysis Technical Manual(Affymetrix, Rev.5, Part number701021)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用GeneChip Operating software (GCOS 1.4，Affymetrix)提取芯片數(shù)據(jù)，用 DNA-chip analyzer(dChip)進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)的歸一化處理。采用SAM3.0軟件(http://www.stat.stanford.edu/～tibs/SAM/)篩選差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為變化倍數(shù)≥2或≤0.5，q≤0.05。運(yùn)用Cluster 3.0軟件(Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA)進(jìn)行聚類分析，采用層次聚類法(Average linkage算法)并用Treeview軟件進(jìn)行查看。運(yùn)用 MAS3.0分子功能注釋系統(tǒng)(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/)對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類(Gene ontology, GO)及通路功能分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)，計(jì)算各功能分類和通路中基因富集的顯著程度，以FDR≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)評估其顯著性。

1.2.4 實(shí)時定量PCR驗(yàn)證表達(dá)譜芯片的檢測結(jié)果

為驗(yàn)證表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果的可靠性，選擇10個差異表達(dá)基因，采用實(shí)時定量PCR方法檢測熱應(yīng)激處理組與對照組各組織中基因的表達(dá)量。qRT-PCR的引物采用 Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，選取的10個基因及其引物信息見表1，以β-actin為內(nèi)參基因。

采用熒光試劑SYBR? Premix ExTaqTM進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測，檢測樣本的總RNA量為2 μg，反應(yīng)體系為15 μL，包括cDNA第一鏈模板1 μL，mixture混合溶液 7.5 μL，上下游引物各 0.1 μL，ddH2O 6.3 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，55 ℃ ～60 ℃ 35 s ，72℃ 40 s，45個循環(huán)。溶解曲線檢測條件為：95℃ 5 s；65 ℃ 1 min 。每個樣品的表達(dá)量均重復(fù)檢測3次，采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種組織中差異表達(dá)的探針

本研究表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)已提交至NCBI/GEO數(shù)據(jù)庫(GSE23592)。3種組織的熱應(yīng)激處理組與對照組相比，存在顯著差異的探針個數(shù)為 1042個(篩選標(biāo)準(zhǔn)為變化倍數(shù)≥2或≤0.5，q≤0.05)。大腦組織中存在顯著差異的探針共有 183個，其中 129個有基因注釋，105個基因上調(diào)表達(dá)，24個基因下調(diào)表達(dá)；肝臟中存在顯著差異的探針共有558個，其中339個有基因注釋，248個基因上調(diào)表達(dá)，91個基因下調(diào)表達(dá)；腿肌組織中共有301個探針存在顯著差異，其中209個有基因注釋，142個基因上調(diào)，67個基因下調(diào)。

表1 實(shí)時定量PCR檢測的基因及其引物信息

3種組織共有差異表達(dá)探針935個(不同組織間有共同差異表達(dá)探針的只統(tǒng)計(jì)1次)。只在大腦、肝臟和腿肌組織檢測到的具有組織特異性的差異表達(dá)探針分別為142個、470個和224個；不同組織間，大腦和肝臟有30個共同差異表達(dá)探針，大腦和腿肌有19個差異表達(dá)探針，肝臟和腿肌有66個差異表達(dá)探針。3種組織共有8個共同的差異表達(dá)探針，其中 6個具有基因注釋，分別是：HSP25(Heat shock protein 25)，HSPH1(Heat shock 105 kDa/110 kDa protein)，PDK4(Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4)，BAG3(BCL2-associated athanogene3)，LOC423265(Similar to splicing factor, arginine/serine-rich 5＜premRNA splicing factor SRP40)和ID1(Inhibitor of DNA binding 1)，除ID1在熱應(yīng)激處理后表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)外，其余基因均為上調(diào)表達(dá)。

2.2 3種組織中差異表達(dá)的基因

相對于對照組，熱處理組的HSPH1和HSP25在3種組織中均為上調(diào)表達(dá)。HSP70和HSP90B1在大腦和肝臟組織中共同上調(diào)表達(dá)；HSP90AA1、HSPA5、DNAJA4、DNAJB4、HSPB8和HSPA4L只在大腦組織中上調(diào)表達(dá)；LOC777492和DNAJC12在肝臟組織中特異表達(dá)；DNAJB在腿肌組織中特異性下調(diào)表達(dá)。上述不同熱休克蛋白家族基因在不同組織中出現(xiàn)差異表達(dá)，揭示了這些基因在機(jī)體熱適應(yīng)中具有重要的作用。

2.3 差異表達(dá)探針的聚類分析

運(yùn)用Cluster3.0軟件進(jìn)行聚類分析，雙向聚類圖見圖1。3種組織中熱應(yīng)激處理組與對照組的基因表達(dá)分別聚為兩大類，如肝臟 1、2、3為對照組聚為一類，肝臟 4、5、6為熱應(yīng)激組聚為一類，大腦和腿肌組織的聚類結(jié)果與肝臟組織類似。肝臟組織、大腦組織和腿肌組織內(nèi)的6個樣品各分別聚為一大類，表明這3種組織的基因表達(dá)模式差異較大，具有組織表達(dá)的特異性。利用 Cluster3.0 軟件中的SOM過程將935個差異表達(dá)探針聚為9類(表2)。

2.4 差異表達(dá)基因的功能分類

對熱應(yīng)激處理組與對照組的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明：在大腦組織中有39個生物學(xué)過程發(fā)生了顯著改變，包括蛋白質(zhì)折疊、熱應(yīng)答過程、蛋白質(zhì)聚合、細(xì)胞抗凋亡過程等；在肝臟組織中發(fā)生顯著改變的生物學(xué)過程有37個，包括抗細(xì)胞凋亡過程、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞周期等；在腿肌組織中發(fā)生顯著改變的生物學(xué)過程有31個，包括蛋白質(zhì)折疊、代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)節(jié)等。

在大腦組織中有 108個探針為特異性上調(diào)表達(dá)(氮末端聚糖合成、蛋白酪氨酸激酶信號途徑、蛋白質(zhì)氨基酸磷酸化等)。肝臟組織中特異性表達(dá)的探針有492個，其中381個探針上調(diào)表達(dá)(tRNA氨基?；?、糖代謝、脂代謝等)，111個探針為下調(diào)表達(dá)(類固醇和膽固醇的生物合成、多種藥物代謝等)。腿肌組織中特異性表達(dá)的探針有 240個，其中下調(diào)表達(dá)探針 81個(生長調(diào)節(jié)、負(fù)向調(diào)控胰島素受體信號途徑等)，上調(diào)表達(dá)探針159個(透明質(zhì)烷代謝、L-絲氨酸合成、組蛋白脫磷酸等)。大腦、肝臟和腿肌組織在熱應(yīng)激時相關(guān)基因具有不同的表達(dá)模式和特定的生物學(xué)功能，但 3種組織也存在蛋白質(zhì)折疊、抗細(xì)胞凋亡等共同的生物學(xué)過程。

基于KEGG數(shù)據(jù)庫，利用MAS3.0軟件進(jìn)行通路分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腦組織中改變顯著的通路有18個，其中與熱應(yīng)激有關(guān)的是MAPK信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路和鈣離子信號通路等。MAPK信號通路中表達(dá)量顯著改變的基因是PRKACB、PPM1B、MEF2C和HSP70。肝臟組織中改變顯著的通路有58個，與熱應(yīng)激有關(guān)的有鈣離子信號通路、多種代謝通路、類固醇化合物的合成和細(xì)胞周期活動等，其中鈣離子信號通路中表達(dá)量顯著改變的基因是TNNC2、PLCG2、EGFR、EDNRA、CACNA1D和ADCY1。腿肌組織中顯著改變的通路有 51個，與熱應(yīng)激相關(guān)的通路有 p53信號通路、MAPK信號通路、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)化生長因子信號途徑，其中在MAPK信號通路中表達(dá)量顯著改變的基因有PRKCB、MAPK8、MAP3K4、FGFR2和FGF。

2.5 熱應(yīng)激時3種組織中參與代謝反應(yīng)的差異表達(dá)基因

肝臟組織中參與糖代謝的差異表達(dá)基因有PFKFB4、NSDHL、GALE和LYVE1；腿肌中涉及糖代謝的基因有LYG2和ALDOB。肝臟組織中涉及脂類代謝的差異表達(dá)基因有LSS、HSD17B7、FDPS、DHCR7、DHCR24、NR5A2、FABP4、ANGPTL3和QKI等；腿肌組織中與脂類代謝有關(guān)的差異表達(dá)基因有LIPG、APOB、APOH和AGPAT6。大腦組織中參與蛋白質(zhì)代謝的差異表達(dá)基因主要是XPO1和CNP；肝臟組織中參與蛋白質(zhì)代謝的基因有PSEN1和DHCR24；而在腿肌中參與蛋白質(zhì)代謝的差異表達(dá)基因有XPO1、ARNTL、CDO1和AMD1。熱應(yīng)激處理導(dǎo)致雞3種組織的主要代謝反應(yīng)都發(fā)生了改變，但在不同組織中涉及的差異表達(dá)基因并不相同，表明在熱應(yīng)激條件下，大腦、肝臟和腿肌組織具有不同的基因表達(dá)模式。

圖1 3種組織芯片數(shù)據(jù)的雙向聚類結(jié)果

2.6 實(shí)時定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

選擇 10個利用表達(dá)譜芯片檢測到的差異表達(dá)基因，采用實(shí)時定量PCR方法對部分檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。如圖2所示，大腦、肝臟、腿肌組織中利用表達(dá)譜芯片和實(shí)時熒光定量PCR兩種方法所得的基因表達(dá)結(jié)果的趨勢一致，相關(guān)系數(shù)(r)分別為 0.66(P≤0.037)、0.91(P≤0.0002)、0.91(P≤0.0003)，表明表達(dá)譜芯片的檢測結(jié)果可靠。

圖2 表達(dá)譜芯片和實(shí)時熒光定量PCR檢測基因差異表達(dá)倍數(shù)趨勢比較

表2 935個SOM聚類探針數(shù)目情況

3 討 論

在雞3種組織中，HSP25表達(dá)差異較大，在腦組織上調(diào)17.37倍，肝臟組織中上調(diào)25.21倍，腿肌組織中上調(diào) 2.9倍。該基因能夠有效地結(jié)合非天然蛋白并抑制蛋白折疊中間物的聚集[24,25]、抵抗細(xì)胞凋亡、在應(yīng)激中保護(hù)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定[26]，并能在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中抵抗蛋白酶體抑制劑引起的應(yīng)激[27]。研究發(fā)現(xiàn)，HSP25只有在劇烈、致死性熱應(yīng)激條件才能被誘導(dǎo)表達(dá)[28]。雞HSP25能夠抑制細(xì)胞外來物應(yīng)激、侵?jǐn)_導(dǎo)致的蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集[29]。目前研究認(rèn)為，HSP25是一種熱應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志性的蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)HSP25在腦組織與肝臟組織的表達(dá)倍數(shù)明顯高于腿肌組織，提示雞在熱應(yīng)激反應(yīng)過程中，腦組織與肝臟組織優(yōu)先做出反應(yīng)，之后可能通過其他途徑調(diào)控其在別的組織中出現(xiàn)類似反應(yīng)[30]。

在雞3種組織中HSPH1(Hsp105)顯著上調(diào)表達(dá)，在腦組織中上調(diào)2.65倍，肝組織中上調(diào)4.35倍，腿肌組織中上調(diào)7.83倍。HSPH1與Hsp70、Hsp90等熱克休蛋白基因家族成員有相似功能，熱處理細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Hsp105表達(dá)量升高[31,32]，HSP105蛋白還可影響和抑制超氧化歧化酶突變體的聚集[33]。但HSPH1參與雞熱應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制尚未見報(bào)道。

HSP70表達(dá)量升高是有機(jī)體適應(yīng)外界應(yīng)激環(huán)境的本能反應(yīng)。HSP70和HSP90蛋白作為分子伴侶幫助細(xì)胞內(nèi)重要蛋白的正確折疊、避免降解，從而改善細(xì)胞在逆境脅迫下的生存能力[18,34,35]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞在熱應(yīng)激條件下，HSP70、HSP90和HSPA5等基因的表達(dá)量升高，其中HSP70mRNA的表達(dá)具有組織特異性，且在腦組織中的表達(dá)量比肝臟和腿肌組織高，與本課題組前期的研究結(jié)果一致[15]。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動死亡過程[36,37]。半胱天冬蛋白酶(Caspase)在細(xì)胞凋亡過程中起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程[38～40]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞熱應(yīng)激處理組與對照組的大腦組織中有 3個與抗細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)量發(fā)生顯著改變(HSPA5、CRYAB和BAG3)；肝臟組織中有5個相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生顯著改變(PROK2、EEF1A2、DHCR24、BCL2L1和BAG3)；腿肌組織中則有6個相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生顯著改變(SCG2、MITF、MAPK8、EYA1、BAG3和ALB)。BAG3在3種組織中都出現(xiàn)了顯著的差異表達(dá)，BAG3能夠協(xié)同BCL-2影響APAF1而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[41,42]。BAG3在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激源應(yīng)激時還能與熱應(yīng)激蛋白家族成員形成復(fù)合物而產(chǎn)生對應(yīng)激源的耐受[43]，此外BAG3還具有抑制蛋白質(zhì)合成和促進(jìn)蛋白質(zhì)自吞的功能，而該功能同時受到HSF1的調(diào)節(jié)[44,45]。

鈣離子途徑是一種普遍的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制，機(jī)體受到應(yīng)激或細(xì)胞內(nèi)激素釋放時，鈣離子信號途徑通過鈣調(diào)素(CaM)或蛋白激酶(PKC)同工酶的激活和細(xì)胞核運(yùn)輸調(diào)控DNA的復(fù)制、修補(bǔ)一級細(xì)胞循環(huán)等核事件[46]。研究發(fā)現(xiàn)，熱休克能引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生改變、觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子突然增多，正是通過鈣離子結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)為Calmodulin(CaM)鈣調(diào)素蛋白、CaM-相關(guān)蛋白、鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)、神經(jīng)鈣蛋白(CBL)和熱休克蛋白的上調(diào)表達(dá)[47～49]。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子信號通路相關(guān)基因的表達(dá)量在 3種組織中都發(fā)生了顯著改變，包括大腦組織中的TNNC2、PLCB1和PRKACB基因，肝臟組織中的TNNC2、CACNA1D、EGFR、ADCY1、EDNRA和PLCG2基因及腿肌組織中的AGTR1和PRKCB基因。研究表明，應(yīng)激時熱休克蛋白可影響鈣離子的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子電流，增加或激活鈣調(diào)素蛋白[50～52]，而增加鈣離子在細(xì)胞漿內(nèi)的釋放，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的激活而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[53]。因此，熱休克蛋白能協(xié)同抗細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(BAG家族和 Bcl-2家族基因等)發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的功能，而這兩方面的活動相互制約平衡，從而穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境。

MAPK(促細(xì)胞有絲分裂蛋白激酶)信號通路是激活生長因子受體下游的重要靶標(biāo)。MAPK信號通路能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性，包括基因表達(dá)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和凋亡[54]。Nielsen等[20]利用全基因組表達(dá)芯片檢測了果蠅在微熱處理64 h前后基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)果蠅機(jī)體耐熱性與MAPK信號通路內(nèi)的基因表達(dá)量改變有關(guān)。對家豬的研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激誘導(dǎo)MAPK信號通路改變，通過小窩細(xì)胞的增殖和遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞損傷修復(fù)和再生，熱應(yīng)激前后豬大腦組織和腿肌組織中MAPK信號通路中改變的基因有 9個(PRKACB、PPM1B、MEF2C、HSP70、PRKCB、MAPK8、MAP3K4、FGFR2和FGF)。這些基因分別在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和凋亡等生物學(xué)過程中具有重要功能，對機(jī)體細(xì)胞抗熱應(yīng)激起著積極的作用[55]。

本研究在全基因組水平上對雞熱應(yīng)激的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探索。在熱應(yīng)激時，雞大腦、肝臟和腿肌組織具有不同的基因表達(dá)模式。HSP25、HSPH1、PDK4、BAG3和ID1在3種組織中均表現(xiàn)為顯著的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，揭示這些基因在雞的熱應(yīng)激反應(yīng)中具有重要的功能。

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