謝愛英，陳 祎，黨亞麗*，周 玲

（1.西南大學榮昌校區(qū)， 重慶 402460；2.重慶市威士化　工有限公司，重慶 400060；3.浙江省醫(yī)學科學院保健食品研究所，浙江 杭州 310013）

處理發(fā)酵劑對促熟干酪中生物胺和游離氨基酸的影響

謝愛英1，陳 祎2，黨亞麗3,*，周 玲1

（1.西南大學榮昌校區(qū)， 重慶 402460；2.重慶市威士化工有限公司，重慶 400060；3.浙江省醫(yī)學科學院保健食品研究所，浙江 杭州 310013）

以0、30、60、90 d促熟干酪中生物胺（組胺、色胺、苯乙胺、尸胺、酪胺）和游離氨基酸含量為指標，研究了添加復合處理發(fā)酵劑對干酪產生游離氨基酸和生物胺量的影響。結果表明：不同處理發(fā)酵劑添加量對各種生物胺產生的影響不同；添加處理發(fā)酵劑干酪中生物胺和游離氨基酸含量增加，其含量隨著復合處理發(fā)酵劑添加量增加而增加。

促熟干酪；生物胺；游離氨基酸

干酪是以乳、稀奶油、脫脂乳或部分脫脂乳、酪乳或這些原料的混合物為原料，經凝乳酶或其他凝乳劑，并排出部分乳清而制成的新鮮或經發(fā)酵成熟的乳制品[1]。干酪中含有豐富的蛋白質、脂肪、礦物質以及多種維生素，是乳制品中營養(yǎng)價值很高的一種產品，在國外被稱為“乳品之王”，是世界上乳制品的大宗產品之一。干酪的成熟主要是通過蛋白質、脂肪降解形成干酪獨特的風味物質，該過程需在低溫條件下3～6 個月完成，其成熟時間較長且費用較高，因此，干酪促熟已成為研究熱點。自20世紀50年代以來，人們就不斷尋求加速干酪成熟的方法，其基本機理是采用各種物理、化學和生物的方法加快蛋白質和脂肪的分解，在增強干酪的風味、保證風味平衡、感官良好的同時縮短成熟時間。干酪成熟過程中伴隨著蛋白質降解為風味物質的小分子肽及游離氨基酸也積累了胺類物質。生物胺（biogenic amine，BA）是生物胺是具有生物活性的有機的、基本的含氮化合物，主要由氨基酸脫羧形成[2]。生物胺可與亞硝酸鹽發(fā)生反應，生成致癌、致突變、致畸的某些亞硝酸胺類物質，因此攝入過多的生物胺引起人體中毒。采用溶菌酶和超聲波復合處理發(fā)酵劑促熟干酪中生物胺研究的文獻鮮見，本實驗擬在干酪制作過程中添加0、0.5%、1%、2%復合處理發(fā)酵劑，測定促熟干酪中0、30、60、90 d的主要生物胺和游離氨基酸含量，研究促熟生物胺的生成及干酪蛋白的降解，分析二者關系，為干酪生產及質量控制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

原料乳由重慶市榮昌縣遠覺鎮(zhèn)鑫旺公司提供。

干酪發(fā)酵劑FD-DVS R-707、凝乳酶CHY-MAX?M丹麥科漢森公司；溶菌酶（lysozyme，酶活力≥20 000 U/mg）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為純凈水；乙醚、丙酮、鹽酸、三氯乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉均為分析純；標準品：組胺（histamine）、酪胺（tyramine）鹽酸鹽、色胺（serotonin）、苯乙胺（phenethylamine）、尸胺（codetermine）、1,7-庚二胺、丹磺酰氯 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設備

JY96-II超聲波細胞粉碎機 南京馬內利儀器設備有限公司；Avanti J-25貝克曼冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；BvAgilent1100 系列高效液相色譜儀（配有G1311A四元泵、G1321A熒光檢測器、G1331A自動進樣器、G1316A恒溫箱、G1322A在線脫氣裝置及化學工作站、渦流混合器、0.45 μm針頭微孔濾膜過濾器） 日本島津公司；色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 月旭材料科技（上海）有限公司；日立L-8900氨基酸分析儀 日本日立高新技術公司。

1.3方法

1.3.1干酪加工工藝流程

鮮牛乳→標準化→殺菌（在63 ℃殺菌30 min）→冷卻至32 ℃→添加2%的發(fā)酵劑→調整酸度→加0.02%氯化鈣→加凝乳酶→凝塊切割→攪拌→加溫→排除乳清→添加處理發(fā)酵劑→混勻→壓榨→成熟→取樣

1.3.2發(fā)酵劑的處理

取2 g發(fā)酵劑添加200 mL脫脂乳，37 ℃培養(yǎng)12 h，添加溶菌酶1.6 kU/mL，在43 ℃條件下酶解1 h，后經超聲波處理6 min（120 W，10 ℃）。

1.3.3實驗設計

在干酪成熟0、30、60、90 d時，分別取對照（不添加超聲波和溶菌酶復合處理的發(fā)酵劑）、添加0.5%、1.0%、2.0%復合處理發(fā)酵劑的干酪樣品編號后密封并放入冰箱中凍藏。取樣結束后，統(tǒng)一進行生物胺和游離氨基酸含量的測定。

1.4指標測定

1.4.1生物胺含量的測定

1.4.1.1標準溶液的配制與衍生

參照Martuscelli等[3]方法，組胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、色胺標準溶液：分別準確稱取0.034 4、0.024 0、0.021 6、0.034 6、0.029 0 g，水溶后定容至100 mL。每份取樣0.5 mL與150 μL飽和NaHCO3混合，用150 μL 0.1 mol/L NaOH將pH值調至11.5。將2 mL的10 mg/mL的丹磺酰氯加入到胺的提取液中，混合液在40 ℃振蕩保溫60 min進行衍生，剩余的丹黃酰氯用300 g/L的氨水200 μL溶解。20 ℃避光條件下保存30 min后用乙腈定容到5 mL，然后過濾。

1.4.1.2色譜條件

采用高效液相法測定生物胺，色譜條件：流動相為水和乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速均為0.8 mL/min，紫外檢測波長為254 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃。

表1　生物胺衍生樣品含量測定的分離洗脫梯度Table 1 Mobile phase gradient program for separation of benzyl derivatives of biogenic amines

圖 l 生物胺標準品衍生物色譜圖Fig.1 Chromatogram of derivatives of biogenic amines standards

生物胺標準品衍生物圖譜見圖l，其出峰順序：組胺3.00～3.30 min，色胺8.65～8.95 min，苯乙胺9.50～9.80 min，尸胺10.2～10.9 min，酪胺12.8～13.5 min。

1.4.1.3樣品預處理

參照劉振鋒[4]、劉辰麒[5]等方法進行樣品處理，將干酪用研缽研磨均勻，稱取5.0 g置于50 mL離心管中，加250 μL內標（1 000 μg/mL庚胺儲備液），再加20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液分散，均質1 min，振蕩提取5 min，靜置5 min，然后采用5 000×g離心35 min；將上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL高氯酸溶液重復提取1 次，上清液合并至相應容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度；取2 mL該溶液，按標準品的衍生方法處理。實驗中對每個樣品的處理均重復3 次。

1.4.2游離氨基酸含量的測定

委托國家糧食局成都糧油食品飼料質量監(jiān)督檢驗測試中心，采用自動氨基酸分析儀測定，所測游離氨基酸包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸。

1.5數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel處理，并進行方差分析。

2　結果與分析

2.1不同處理對促熟干酪中生物胺含量的影響

2.1.1不同處理對促熟干酪中組胺含量的影響

圖2　不同處理發(fā)酵劑添加量對促熟干酪中組胺含量的影響Fig.2 Influence of the modified starter at different levels on histamine content of cheese during ripening

由圖2可知，在干酪成熟過程中實驗組組胺含量先上升后下降，而對照組的組胺含量不斷升高。這可能是因為溶菌酶破壁后再經超聲的機械效應和空化效應對細胞的破碎處理，在合適的破壁程度下促進了細胞內酶的釋放，加速了蛋白質的降解。另外，干酪中殘存微生物含量增加也使干酪中生物胺的含量增加[6-7]。添加不同量復合處理發(fā)酵劑對干酪中組胺含量的影響不同，這可能是因為復合處理發(fā)酵劑添加量不同釋放的蛋白酶量不同。對照組和實驗組對比，0～60 d實驗組的組胺含量高于對照組，30 d時，實驗組添加復合處理發(fā)酵劑為1%干酪組胺含量達到最高為249.97 mg/kg；而60～90 d時，實驗組組胺含量均低于對照組。添加處理發(fā)酵劑可顯著（P＜0.05）增加成熟期間干酪中組胺含量，其中添加1%和2%處理發(fā)酵劑實驗組差異不顯著，但二者顯著高于添加0.5%實驗組的組胺含量。實驗中組胺含量從0 d開始就比較高，可能與原料乳及原料乳中腸球菌數(shù)有關[8]。綜上所述，復合處理發(fā)酵劑可以影響成熟期間促熟干酪中組胺的生成量，且成熟末期低于未添加復合處理發(fā)酵劑的干酪。

2.1.2不同處理對促熟干酪中色胺含量的影響

圖3　不同處理發(fā)酵劑添加量對促熟干酪中色胺含量的影響Fig.3 Influence of the modified starter at different levels on tryptamine content of cheese during ripening

由圖3可知，在0～90 d的成熟期間，添加復合處理發(fā)酵劑實驗組色胺含量逐漸升高，對照干酪組色胺含量先上升后下降。其中復合處理發(fā)酵劑添加為2%的干酪在60～90 d呈持續(xù)上升趨勢，而添加量為0.5%和1%的在60 d達到最高。這可能原因是添加的溶菌酶和超聲復合處理的發(fā)酵劑越多，干酪中蛋白酶與微生物含量越多，生成色胺的量越多[9]。對照組和實驗組對比，0～60 d時實驗組色胺的含量低于對照組的含量，60～90 d時，實驗組的色胺含量高于對照組，復合處理發(fā)酵劑添加為2%的干酪在90 d時色胺最大值為3.03 mg/kg。0～90 d成熟期間，添加1%和2%處理發(fā)酵劑實驗組顯著（P＜0.05）增加了干酪中色胺的含量。綜上分析，復合處理發(fā)酵劑可以影響成熟期間促熟干酪中色胺的生成量。

2.1.3不同處理對促熟干酪中苯乙胺含量的影響

圖4　不同處理發(fā)酵劑添加量對促熟干酪中苯乙胺含量的影響Fig.4 Influence of the modified starter at different levels on phenethylamine content of cheese during ripening

由圖4可知，在成熟的30 d與60 d時實驗組干酪與對照組苯乙胺的含量基本持平。在90 d時，添加復合處理發(fā)酵劑實驗組的苯乙胺含量高于對照組。產生苯乙胺的微生物主要是腸球菌[10]和乳酸菌[11]，可能與條件處理發(fā)酵劑增加了干酪中的產苯乙胺微生物的數(shù)量。其中，添加復合處理發(fā)酵劑為2%干酪中苯乙胺含量最高為2.90 mg/kg。0～90 d成熟期間添加處理發(fā)酵劑1%和2%顯著（P＜0.05）增加了促熟干酪中苯乙胺的含量。綜上分析，復合處理發(fā)酵劑可以影響促熟干酪中苯乙胺的生成量，添加量不同影響效果不同。

2.1.4 不同處理對促熟干酪中尸胺含量的影響

圖5　不同處理發(fā)酵劑添加量對促熟干酪中尸胺含量的影響Fig.5 Influence of the modified starter at different levels on cadaverine content of cheese during ripening

由圖5可知，對照組和添加復合處理發(fā)酵劑干酪中尸胺含量都是呈下降、升高、下降趨勢。后期下降可能是因為此階段微生物的生長大量的消耗了氨基酸的量[12]，使得能用來產生生物胺的氨基酸的量減少。在30～90 d時，對照組干酪中尸胺含量高于添加復合處理發(fā)酵劑干酪中尸胺含量，這可能是因為在干酪成熟后期有部分腸桿菌出現(xiàn)，腸桿菌具有較強的脫羧酶活性，尤其是對于尸胺生成活性較強[13]，而在實驗組添加了處理發(fā)酵劑，對腸桿菌的部分抑制作用也抑制了尸胺的生成。添加處理發(fā)酵劑干酪中尸胺的含量顯著（P＜0.05）低于對照組，添加處理發(fā)酵劑1%的干酪在成熟期間尸胺含量沒有明顯（P＞0.05）增加，可能與其受腸桿菌污染較少所致。由上可以看出，添加復合處理發(fā)酵劑影響了干酪中尸胺的含量，且在成熟末期促熟干酪低于未添加復合處理發(fā)酵劑的干酪。

2.1.5不同處理對促熟干酪中酪胺含量的影響

圖6　不同處理發(fā)酵劑添加量對促熟干酪中酪胺含量的影響Fig.6 Influence of the modified starter at different levels on tyramine content of cheese during ripening

由圖6可知，添加復合處理發(fā)酵劑干酪中酪胺呈先下降后上升趨勢，而對照組干酪中酪胺含量呈先上升后下降趨勢。與Komprda等[14]研究的不同，酪胺含量隨著成熟期的延長而增加，與成熟期成正相關，可能是干酪中生物胺的含量極大的受干酪種類，成熟時間，制作工藝和微生物的影響[3]。成熟期間添加處理發(fā)酵劑的干酪顯著（P＜0.05）增加了干酪中酪胺的含量，在90 d時添加復合處理發(fā)酵劑干酪中酪胺含量高于對照組干酪中酪胺含量，添加0.5%復合處理發(fā)酵劑的干酪在90 d時酪胺含量最高為6.09 mg/kg。綜上分析，復合處理發(fā)酵劑可以增加促熟干酪中酪胺的生成量。

2.2不同添加量的復合處理發(fā)酵劑對干酪成熟期間游離氨基酸含量的影響

圖7　不同處理發(fā)酵劑添加量對干酪中的游離氨基酸含量影響Fig.7 Influence of the modified starter at different levels on free amino acid content of cheese during ripening

由圖7可知，添加復合處理發(fā)酵劑和對照組干酪中游離氨基酸含量都呈先上升后下降趨勢，這與Gardini等[10]研究的趨勢一致。 其中，干酪成熟的0～30 d游離氨基酸增加不明顯，而在30～60 d期間增加較明顯，之后下降?？赡苁且驗樵诔墒烨捌谥饕悄槊附到獯蠓肿永业鞍诪殡亩蔚倪^程[15]，而復合處理發(fā)酵劑增加了干酪中的細胞內酶的含量，其主要作用是水解中間型號的肽[16]，因此在30～60 d氨基酸含量增加。而后期由于氨基酸進一步降解為小分子物質而使其含量降低。添加復合處理發(fā)酵劑干酪中游離氨基酸含量顯著高于（P＜0.05）對照組干酪中游離氨基酸含量，且復合添加劑添加量越多游離氨基酸含量也越高。綜上分析，添加復合處理發(fā)酵劑的含量越多，游離氨基酸生成的量也就越多。

3　討 論

3.1干酪中添加處理發(fā)酵劑對其生物胺含量影響

隨著復合處理發(fā)酵劑含量增多，干酪中產生的生物胺總量也越多。這可能是復合處理發(fā)酵劑增加了干酪成熟過程中蛋白質的分解以及微生物殘留不同所致[17-18]。干酪中添加的復合處理發(fā)酵劑越多，微生物釋放的細胞內蛋白酶的含量就越多，蛋白質降解產生的游離氨基酸越多。蛋白質的降解提高了肽和氨基酸的濃度，為脫羧酶的微生物群提供了胺產生的前體物質[6]，這也是導致生物胺含量增加的重要因素。實驗中0 d樣品中的生物胺和游離氨基酸有所不同，與處理發(fā)酵劑有關，因處理發(fā)酵劑是采用干粉發(fā)酵劑經過培養(yǎng)后，經過溶菌酶和超聲波復合處理，該過程中會產生部分胺類物質和游離氨基酸。另外，在干酪制作過程中，不同的樣品處理有所差別，在凝乳中添加處理發(fā)酵劑的過程中，除了增加干酪中發(fā)酵劑微生物及其酶的含量外，也增加了少數(shù)非發(fā)酵劑微生物的含量，這些微生物及其分泌酶的作用使得0 d樣品中的生物胺和游離氨基酸含量不同。

3.2干酪成熟的時間不同產生生物胺的總量也不同

成熟時間也是影響干酪中生物胺含量的一個重要因素。在干酪成熟60 d時添加0.5%復合處理發(fā)酵劑產生生物胺的總量最多，為257.18 mg/kg，低于常規(guī)干酪生物胺含量[19-20]，其他干酪在成熟30 d時生物胺含量最高，對照、0.5%和2%分別為51.57、127.13、213.11 mg/kg，低于半硬質干酪中生物胺含量[17]。在成熟90 d時，干酪中生物胺的總量降低，與氨基酸底物[12]及微生物胺氧化酶[3]有關。

4　結 論

通過測定0、30、60、90 d促熟干酪中生物胺含量的研究，表明干酪中添加復合處理發(fā)酵劑對不同種類生物胺含量的影響不同。添加復合處理發(fā)酵劑可增加干酪中生物胺的總量；隨著復合處理發(fā)酵劑添加量的增加，產生生物胺的總量也逐漸上升，30 d或60 d時達最高。復合處理發(fā)酵劑對游離氨基酸的影響與生物胺總量相同。

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Effect of Modified Starter on Biogenic Amines and Free Amino Acids during the Accelerated Ripening of Cheese

XIE Ai-ying1, CHEN Yi2, DANG Ya-li3,*, ZHOU Ling1
(1. Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing 402460, China; 2. Chongqing Weishi Chemical Industry Co. Ltd., Chongqing 400060, China; 3. Institute of Health Food, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China)

The starter culture used for producing cheese in this study was modified by sequential treatment with lysozyme and then ultrasonic irradiation after culture in the presence of skim milk, and the modified product was added at different levels to the cheese to accelerate the ripening process. By doing so, this study aimed t o examine the effect of the modified starter on the formation of free amino acids and biogenic amines including histamine, tyramine, phenylethylamine, tryptamine and cadaverine during the accelerated ripening of cheese. The contents of these compounds after 0, 30, 60 and 90 days of ripening were determined. Results showed that the contents of biogenic amine and free amino acids were higher in cheese ripened with the modified starter than in the control group during cheese ageing, indicating that the addition of the modified starter can result in higher contents of biogenic amines and free amino acids in a concentration-dependent manner.

cheese; biogenic amines; free amino acids

TS252.53

A

1002-6630（2014）15-0188-05

10.7506/spkx1002-6630-201415038

2013-07-16

中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目（XDJK2010C015）；浙江省衛(wèi)生廳一般計劃研究項目（2011KYB002）；

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101344）

謝愛英（1973—），女，講師，碩士，研究方向為畜產品加工。E-mail：xay086@126.com

*通信作者：黨亞麗（1978—），女，副研究員，博士，研究方向為生物活性肽與保健食品開發(fā)。E-mail：dangyali1978@126.com