祝 倩，郭宇星,*，潘道東,，曾小群，孫楊贏，周慧敏

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

Caco-2細胞模型構(gòu)建及抗高血壓肽VPP和IPP小腸吸收機制研究

祝 倩1，郭宇星1,*，潘道東1,2，曾小群2，孫楊贏2，周慧敏1

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

Caco-2細胞模型為小腸內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)運模型，本實驗構(gòu)建Caco-2細胞模型并研究抗高血壓肽Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP）的小腸吸收機制。從細胞形態(tài)、電阻值和熒光素鈉透過率等方面驗證了Caco-2細胞模型；通過轉(zhuǎn)運時間、肽濃度、吸收抑制劑和促進劑比較了VPP和IPP的小腸轉(zhuǎn)運途徑及外排機制。結(jié)果表明：構(gòu)建的Caco-2細胞模型可用于VPP和IPP的模擬小腸吸收機制研究；VPP和IPP的小腸轉(zhuǎn)運途徑是旁路轉(zhuǎn)運，VPP和IPP都存在外排泵的作用，IPP外排作用沒有VPP大，所以生物利用度高于VPP。

抗高血壓肽；Val-Pro-Pro；Ile-Pro-Pro；Caco-2細胞；轉(zhuǎn)運

Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP）是從瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中分離出的具有抗高血壓活性的肽，它們除了表現(xiàn)出有效的體外血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE）抑制活性，在用自發(fā)性高血壓大鼠的體內(nèi)實驗中也表現(xiàn)出了降低血壓的作用[1]。Nakamura等[2]在1995年用Lactobacillus helveticus和Saccharomyces cerevisiae作為發(fā)酵劑制作了一種名為Calpis的酸乳飲料，經(jīng)自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneonsly hypertensive rats，SHP）長期服用后，可抑制血壓上升，隨后從Calpis中提取出具有ACE抑制活性的2 種活性短肽——VPP和IPP，實驗表明，Calpis的ACE抑制活性主要是這2 種肽的作用。

Caco-2細胞最初于1977年從人類結(jié)腸腺癌細胞中分離所得[3]。將細胞接種到聚碳酸酯膜或聚酯膜上，經(jīng)過約21 d的培養(yǎng)，形成連續(xù)的單層并且具備與人類小腸上皮細胞相似的微絨毛結(jié)構(gòu)，部分表達出與小腸上皮相同的某些特征酶，如氨基肽酶、酯酶、乳糖酶、蔗糖酶等[4]。Caco-2細胞模型與其他用來研究吸收的模型相比，重復性較好，模型穩(wěn)定并且應用范圍廣，成為一種研究藥物吸收的快速篩選工具，可以提供藥物分子穿過小腸黏膜的吸收、代謝、轉(zhuǎn)運的情況[5]。構(gòu)建Caco-2細胞模型時，需對形態(tài)學、熒光素鈉透過量、跨膜電阻等參數(shù)進行測定和評估，確保Caco-2細胞模型可作為小腸內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)運模型[6]。

Ohsawa等[7]通過實驗得出VPP和IPP能抵制住胃腸道分泌出的蛋白酶，不會被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰液素水解，并發(fā)現(xiàn)這兩個三肽在Caco-2細胞模型中不會被酶解，表明口服VPP和IPP能在腸道中保持結(jié)構(gòu)完整，并能保持活力直到吸收。Pijl等[8]研究VPP和IPP在豬體內(nèi)的藥代動力學時發(fā)現(xiàn)，這兩種三肽都能以完整的形式進入血液循環(huán)，而且有絕對的生物利用度。由此可知，VPP和IPP是以完整結(jié)構(gòu)通過小腸吸收，但其吸收機制尚未完全確定。因此，本實驗建立并驗證了Caco-2細胞模型，并通過此模型研究抗高血壓肽VPP和IPP的跨小腸上皮細胞的轉(zhuǎn)運機制，此模型的確定為研究同類短肽提供實驗基礎，對短肽的小腸吸收機制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Caco-2細胞 南京凱基生物科技有限公司；VPP、IPP、Gly-Pro（純度＞95%） 上海楚肽生物科技有限公司合成。

不完全DMEM培養(yǎng)基（原裝Gibco干粉配制，含1%雙抗）、胎牛血清（特優(yōu)級Gibco），以及實驗所需的緩沖液 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 北京索萊寶科技有限公司；非必需氨基酸、青鏈霉素混合液、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 美國Amresco公司；熒光素鈉、維拉帕米、MK-571鈉鹽、去氧膽酸鈉、渥曼青霉素（wortmannin） 美國Sigma公司；疊氮化鈉 浙江省東陽市天宇化工有限公司。

1.2 儀器與設備

12孔Transwell培養(yǎng)板（聚酯膜，孔徑0.4 μm，膜面積1.12 cm2） 美國康寧公司；Millicell ERS-2電阻儀 美國Millipore公司；XD-202型倒置生物顯微鏡 南京江南永新光學有限公司；MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司；25 cm2密封蓋培養(yǎng)瓶 丹麥NUNC公司；754紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Agilent高效液相色譜儀（配置C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）） 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 Caco-2細胞模型的建立[9]

將含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作為Caco-2細胞的培養(yǎng)液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液一次。細胞在瓶中長至80%～90%時，吸棄舊的培養(yǎng)液，加入0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液進行消化，用DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，以密度2×105cells/mL接種于12 孔Transwell板的濾膜上。在濾膜的頂側(cè)（apical side，AP）和基底側(cè)（basolateral side，BL）分別加入細胞懸液0.5 mL和DMEM培養(yǎng)液1.5 mL。24 h后換培養(yǎng)液，前7 d隔天換液，以后每天換液，培養(yǎng)21 d。

1.3.2 Caco-2細胞模型的評價指標

1.3.2.1 細胞形態(tài)學觀察[10]

培養(yǎng)至21 d時，將細胞單層用HBSS（Hanks’balanced salt solutions）溶液清洗3 次，切下聚脂膜，固定于體積分數(shù)3%戊二醛，再用體積分數(shù)1%四氧化鋨固定，丙酮逐級脫水，以不氧樹脂Epon812為包埋劑，半薄切片定位后進行超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察其特征的微絨毛結(jié)構(gòu)。微絨毛的特征表現(xiàn)和細胞特點的緊密性可以反映出細胞層的分化程度。

1.3.2.2 細胞單層完整（緊密）性測定

用細胞電阻儀隔天測定跨上皮細胞電阻（transepithelial electrical resistance，TEER），以了解細胞單層完整性與緊密性動態(tài)形成過程。

一般TEER值介于200～1 000 Ω·cm2，電阻值越大，表示單層越致密。

1.3.2.3 熒光素鈉滲漏檢查

采用熒光素鈉來驗證被動擴散的跨膜通量[11]。熒光素鈉水溶性極強，且從細胞間隙進行轉(zhuǎn)運，通常被用來檢測細胞單層的完整性。以未接種細胞的Transwell培養(yǎng)皿用HBSS緩沖液分別配制0.5、1、2、4、10 μg/mL熒光素鈉標準溶液，在492 nm波長處檢測，以吸光度為縱坐標，熒光素鈉質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到方程：y=108.87x+0.018 0（R2=0.998 1），線性范圍0.5～10 μg/mL。細胞在Transwell板上生長達21 d后，棄去培養(yǎng)液，用預熱至37 ℃的HBSS清洗3 次。第3次放入CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，小心吸棄HBSS，每孔AP側(cè)加入0.5 mL 0.4 g/L熒光素鈉，BL側(cè)加入1.5 mL HBSS，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在30、60、90、120、150 min分別取底側(cè)HBSS，在紫外-可見分光光度計492 nm波長處測定吸光度，以未接種細胞的培養(yǎng)皿作為空白組，按公式（2）計算透過率。

1.3.3 VPP和IPP跨細胞膜轉(zhuǎn)運

1.3.3.1 肽跨細胞轉(zhuǎn)運實驗

細胞用HBSS（pH 7.4）緩沖液小心沖洗3 次，第3次在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min后輕輕吸去孔內(nèi)HBSS。在AP側(cè)加入含有肽的HBSS緩沖液0.5 mL，在BL側(cè)加入HBSS 1.5 mL。每次取樣500 μL并補上同樣量的HBSS緩沖液，樣品中的VPP和IPP的含量用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定。BL側(cè)取出的轉(zhuǎn)運樣品經(jīng)0.22 μm膜過濾進樣。色譜條件：流動相：22%乙腈，0.05% 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）；流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，在波長202 nm處檢測峰值。

1.3.3.2 轉(zhuǎn)運時間對VPP跨膜轉(zhuǎn)運的影響

在Transwell板的AP側(cè)加1 mmol/L的VPP，在37 ℃孵育0.5、1、1.5、2 h后從BL側(cè)取樣，通過HPLC測定VPP濃度。

1.3.3.3 肽濃度對VPP跨膜轉(zhuǎn)運的影響

在AP側(cè)分別加1、2、3、4、5 mmol/L的VPP，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后從BL側(cè)取樣，通過測定VPP濃度確定VPP跨細胞膜轉(zhuǎn)運量。

1.3.3.4 VPP及IPP的跨膜轉(zhuǎn)運機制

在Transwell板的AP側(cè)分別加入肽轉(zhuǎn)運載體競爭性抑制劑10 mmol/L Gly-Pro、內(nèi)吞抑制劑500 nmol/L的Wortmannin和旁路轉(zhuǎn)運促進劑100 μmol/L去氧膽酸鈉[12-13]，對BL側(cè)樣品做液相分析肽濃度。

1.3.3.5 VPP及IPP的外排機制

在AP側(cè)分別加入100 μmol/L的P-糖蛋白抑制劑維拉帕米、50 μmol/L多藥耐藥蛋白抑制劑MK-571和10 mmol/L的ATP能量生成抑制劑疊氮化鈉[13]，轉(zhuǎn)運1 h后，對BL側(cè)樣品做液相分析肽濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，單因素方差分析檢驗組間顯著性差異，數(shù)據(jù)用示，組間差異顯著性采用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 Caco-2細胞模型的建立及驗證

2.1.1 細胞形態(tài)學檢查

由圖1可知，細胞單層上側(cè)分化出了微絨毛結(jié)構(gòu)，刷狀緣非常整齊致密。細胞間有緊密連接結(jié)構(gòu)，且緊密連接只出現(xiàn)在腔側(cè)。微絨毛是Caco-2細胞分化后的典型特征，微絨毛（圖1a）、緊密連接（圖1b）的出現(xiàn)說明Caco-2細胞已成不對稱分布，具有小腸上皮細胞的某些結(jié)構(gòu)特征。

圖1 透射電鏡下觀察Caco-2細胞單層Fig.1 Transmission electron microscope picture of Caco-2 cells

2.1.2 細胞單層完整性

圖2 Caco-2細胞的TEER值與生長時間的關系Fig.2 Relationship between transepithelial electrical resistance of Caco-2 monolayers and culture time

由圖2可知，Caco-2細胞單層的緊密性隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增高。第21天時已達500 Ω·cm2多。細胞的跨膜電阻在第1周增加緩慢，到第7天電阻還沒達到100 Ω·cm2，而后快速增加，到第14天時已經(jīng)介于300～400 Ω·cm2之間，最后1 周緩慢增加，到21 d時跨膜電阻增至519 Ω·cm2。本實驗建立的Caco-2細胞模型TEER值為400～700 Ω·cm2，符合實驗要求。

2.1.3 熒光素鈉滲漏檢查

圖3 熒光素鈉透過Transwell的透過率和時間的關系Fig.3 Relationship between fluorescein permeability and time

由圖3可知，空白組的熒光素鈉透過率較實驗組高。接入熒光素鈉0.5～2.5 h時，空白組透過率由7.6%增至29.6%，實驗組透過率從0.6%增至6.4%。熒光素鈉是Caco-2細胞單層模型跨細胞被動轉(zhuǎn)運的標記物，根據(jù)國際上對藥物吸收難易的標準，表觀通透系數(shù)Papp＜1.0×10-6cm/s為吸收不良藥物，吸收率在0～20%[14]，本實驗熒光素鈉在2.5 h內(nèi)吸收率為6.4%，表明細胞單層緊密，可作為建模的基礎。

2.2 VPP和IPP的跨膜轉(zhuǎn)運特性

2.2.1 轉(zhuǎn)運時間對VPP跨膜轉(zhuǎn)運的影響

圖4 轉(zhuǎn)運時間對VPP跨Caco-2細胞膜轉(zhuǎn)運的影響Fig.4 Time-course curve of VPP transport across the Caco-2 cell monolayer

由圖4可知，VPP在2 h內(nèi)的轉(zhuǎn)運量隨時間延長而增加，在0.5 h內(nèi)BL側(cè)肽濃度迅速增加，0.5 h后濃度增長速率降低。隨著肽從AP側(cè)轉(zhuǎn)運至BL側(cè)，AP側(cè)肽濃度降低，而BL側(cè)肽濃度升高，濃度差的縮小使其轉(zhuǎn)運速率逐步降低，而肽轉(zhuǎn)運的理想透過率為50%，綜合考慮實驗效果和時間因素，將轉(zhuǎn)運時間定為1 h，此時肽透過率為34%，占理想值的68%。

2.2.2 肽濃度對VPP跨膜轉(zhuǎn)運的影響

圖5 VPP濃度對VPP跨Caco-2細胞膜轉(zhuǎn)運的影響Fig.5 Concentration dependence of VPP transport across the Caco-2 cell monolayer

由圖5可知，轉(zhuǎn)運時間為1 h時，VPP的透過率隨VPP的初始濃度的升高而升高。VPP的轉(zhuǎn)運是濃度依賴型的，隨著AP側(cè)給藥濃度的增加，VPP穿過Caco-2細胞至BL側(cè)的量隨著增加，且沒有達到飽和，說明VPP透過Caco-2單層細胞層以被動轉(zhuǎn)運為主。為了避免飽和，結(jié)合參考文獻[12]，接下來實驗中VPP和IPP在AP側(cè)給藥的濃度取1 mmol/L。

2.2.3 VPP及IPP的跨膜轉(zhuǎn)運機制

藥物通過細胞膜有以下幾種機制：通過細胞之間連接的轉(zhuǎn)運、被動的穿越細胞胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運、主動的載體介導的轉(zhuǎn)運及藥物外流和胞飲路徑。被動轉(zhuǎn)運是由于物質(zhì)的溶解性通過細胞膜，無需膜蛋白的參與；旁路是從細胞之間的間隙進入細胞；內(nèi)吞作用不必結(jié)合于細胞膜上，以囊泡內(nèi)化于細胞；載體運輸經(jīng)細胞膜上的載體蛋白質(zhì)傳送，無需經(jīng)由囊泡內(nèi)化[15]。

圖6 Wortmannin、Gly-Pro和去氧膽酸鈉對VPP轉(zhuǎn)運的影響Fig.6 Effects of wortmannin, Gly-Pro and sodium deoxycholate on the transepithelial transport of VPP across the Caco-2 cell monolayer

圖7 Wortmannin、Gly-Pro和去氧膽酸鈉對IPP轉(zhuǎn)運的影響Fig.7 Effects of wortmannin, Gly-Pro and sodium deoxycholate on the transepithelial transport of IPP across the Caco-2 cell monolayer

據(jù)報道PepT1是二肽和三肽的特定轉(zhuǎn)運載體[16]，Gly-Pro是肽載體PepT1的好的底物，并且能抵御住刷狀緣肽酶的水解，所以Gly-Pro經(jīng)常用來分析肽轉(zhuǎn)運載體的作用。如果PepT1介導肽的轉(zhuǎn)運，加了Gly-Pro的系統(tǒng)里，部分PepT1用于和Gly-Pro結(jié)合，使得作用于肽的轉(zhuǎn)運載體量減少，進而導致肽轉(zhuǎn)運量降低。圖6顯示轉(zhuǎn)運1 h后，Gly-Pro對BL側(cè)VPP有轉(zhuǎn)運抑制作用，但不顯著，表明肽載體可能不是VPP轉(zhuǎn)運過程中的主要機制。Wortmannin是內(nèi)吞抑制劑，抑制藥物跨細胞過程中的內(nèi)吞作用，但Wortmannin沒有顯著降低BL側(cè)VPP的濃度，說明內(nèi)吞不是VPP跨細胞膜的轉(zhuǎn)運機制。去氧膽酸鈉是旁路轉(zhuǎn)運促進劑，能增強旁路轉(zhuǎn)運的透過能力，去氧膽酸鈉對VPP轉(zhuǎn)運有顯著的促進作用（P＜0.01），表明VPP主要以旁路擴散的機制被小腸上皮細胞吸收。綜合圖6、7得知IPP的主要轉(zhuǎn)運機制與VPP相似，也是旁路轉(zhuǎn)運途徑。

2.2.4 VPP及IPP的外排機制

P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白（multi-drug resistant protein，MRP）均為Caco-2細胞中主要的能量依賴性外排轉(zhuǎn)運蛋白，通過ATP供能。P-糖蛋白可以將多種化學上不相關的內(nèi)源性和外源性化合物排到細胞膜外。P-糖蛋白和MRP中的MRP2位于Caco-2細胞的AP側(cè)，可以將細胞內(nèi)藥物外排至AP側(cè)，導致藥物吸收量減少，不利于吸收[17-18]。維拉帕米是P-糖蛋白抑制劑，抑制P-糖蛋白的外排作用。MK-571是MRP2的抑制劑，抑制其外排作用。疊氮化鈉是ATP能量生成抑制劑，抑制能量生成。

圖8 維拉帕米、MK-571和疊氮化鈉對VPP轉(zhuǎn)運的影響Fig.8 Effects of verapamil, MK-571 and sodium azide on the transepithelial transport of VPP across the Caco-2 cell monolayer

由圖8可知，MK-571對VPP從AP側(cè)至BL側(cè)的轉(zhuǎn)運影響不明顯，而維拉帕米的有非常顯著的促進作用。說明VPP在吸收過程中的外排主要是由P-糖蛋白介導的。P-糖蛋白是能量依賴性的外排泵，消耗能量，加了疊氮化鈉的VPP的濃度大于沒有加疊氮化鈉的濃度，說明抑制住部分ATP生成，影響了外排轉(zhuǎn)運蛋白起作用，驗證P-糖蛋白介導了VPP的外排。

圖9 維拉帕米、MK-571和疊氮化鈉對IPP轉(zhuǎn)運的影響Fig.9 Effects of verapamil, MK-571 and sodium azideon on the transepithelial transport of IPP across the Caco-2 cell monolayer

由圖9可知，MK-571和維拉帕米對IPP從AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運影響都不大。疊氮化鈉的加入增加了BL側(cè)IPP的濃度，說明IPP在Caco-2細胞中的轉(zhuǎn)運可能存在外排泵的作用。

3 討 論

本實驗建立了Caco-2細胞模型并從細胞形態(tài)、跨膜電阻和熒光素鈉通量等方面驗證了該模型。微絨毛結(jié)構(gòu)是Caco-2細胞模型的典型特點，與小腸細胞相似。在電鏡的觀察下，細胞分化良好，有緊密連接和致密的微絨毛。電阻值是離子經(jīng)細胞旁間隔的流動而形成的。跨膜電阻隨著培養(yǎng)時間增加而增大，到21 d時增至519 Ω·cm2，完全符合要求。本實驗建立的Caco-2細胞模型，細胞生長具有較好的完整性，且細胞產(chǎn)生極性分化，在形態(tài)上與小腸上皮細胞類似，可作為模擬小腸吸收的體外模型。

由VPP和IPP的轉(zhuǎn)運實驗得知，VPP的跨膜轉(zhuǎn)運是濃度依賴型的。肽轉(zhuǎn)運載體競爭性抑制劑Gly-Pro和內(nèi)吞抑制劑Wortmannin對VPP和IPP的轉(zhuǎn)運影響不顯著，旁路轉(zhuǎn)運促進劑去氧膽酸鈉對轉(zhuǎn)運有明顯的促進作用，旁路轉(zhuǎn)運是VPP和IPP的主要轉(zhuǎn)運途徑。旁路轉(zhuǎn)運是一種不被降解的轉(zhuǎn)運途徑，保證轉(zhuǎn)運過去的肽是完整的[19]。旁路轉(zhuǎn)運是通過細胞間的連接，是一種依賴能量的被動轉(zhuǎn)運[20]。

由VPP和IPP的外排實驗得知，VPP的外排過程由P-糖蛋白介導，IPP在可能存在外排泵的作用，外排作用沒有VPP大，所以生物利用度高于VPP。這與以前的報道結(jié)果相一致，潘道東[1]從Lactobacillus helveticus JCM1004和Lactobacillus casei subsp. casei ATCC393制作的酸乳中分離獲得了2 種肽VPP和IPP，經(jīng)測定VPP和IPP的IC50值分別為8.89 μmol/L和5.17 μmol/L，說明在相同劑量下，IPP的降高血壓效果比VPP強。IPP和VPP都是非極性氨基酸，IPP與VPP比較多了一個甲基，IPP和VPP外排機制的差異可能由甲基引起，將對其做進一步研究。

本實驗對IPP和VPP的跨Caco-2細胞膜吸收機制的實驗研究便于找出生物利用度高的抗高血壓肽和其結(jié)構(gòu)特征，為這些肽提高生物利用度并起到更好的抗高血壓的作用提供可能。

[1] 潘道東. 酸乳中抗高血壓肽的分離及其特性研究[J]. 食品科學, 2005, 26(1): 205-210.

[2] NAKAMURA Y, YAMAMOTO N, SAKAI K, et al. Antihypertensive effect of sour milk and peptides isolated from it that are inhibitors to angiotensin I-converting enzyme[J]. Journal of Dairy Science, 1995b, 78(6): 1253-1257.

[3] FOGH J, FOGH J M, ORFEO T. One hundred and twenty-seven cultured human tumor cell lines producing tumors in nude mice[J]. Journal of the National Caccer Institute, 1977, 59(1): 221-226

[4] 馬博, 孫桂波, 楊志宏, 等. 腸上皮細胞模型不同培養(yǎng)條件的優(yōu)化及適應性研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(11): 205-210.

[5] 牟永平, 吳剛, 周立社, 等. Caco-2細胞模型在藥物研究中的應用[J].中國藥理學通報, 2005, 21(5): 536-539.

[6] 曾寶, 王春玲, 吳安國, 等. Caco-2 細胞模型的建立及其在中藥吸收研究中的應用探討[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2010, 21(6): 570-573.

[7] OHSAWA K, SATSU H, OHKI K, et al. Producibility and digestibility of antihypertensive beta-casein tripeptides, Val-Pro-Pro and Ile-Pro-Pro, in the gastrointestinal tract: analyses using an in vitro model of mammalian gastrointestinal digestion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemisry, 2008, 56(3): 854-858.

[8] van der PIJL P C, KIES A K, TEN HAVE G A M, et al. Pharmacokinetics of proline-rich tripeptides in the pig[J]. Peptides, 2008, 29(12): 2196-2202.

[9] 馬燕, 李沛波, 蘇薇薇, 等. 藥理實驗中Caco-2細胞模型建立的評價指標[J]. 中藥材, 2006, 29(9): 946-948.

[10] 鄢良春, 劉青春, 趙軍寧, 等. 鼠尾膠原對Caco-2細胞模型建立的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2010, 26(5): 155-157.

[11] 孫敏捷, 盛星, 胡一橋. Caco-2細胞單層模型的建立與驗證[J]. 中國藥學雜志, 2006, 41(18): 1431-1434.

[12] SATAKE M, ENJOH M, NAKAMURA Y, et al. Transepithelial transport of the bioactive tripeptide, Val-Pro-Pro, in human intestinal Caco-2 cell monolayers[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2002, 66(2): 378-384.

[13] 劉冬, 孫海燕, 雷林, 等. 降血壓肽Val-Leu-Pro-Val-Pro在Caco-2細胞模型中的吸收機制[J]. 營養(yǎng)學報, 2008, 30(4): 354-362.

[14] YEE S Y. in vitro permeability across Caco-2 cell (colonic) can perdict in vivo (small intestinal) absorption in man-fact or myth[J]. Pharmaceutical Research, 1997, 14(6): 763-766.

[15] 曹文紅, 章超樺. 生物活性肽的吸收機制[J]. 藥物生物技術, 2006, 13(5): 384-388.

[16] LEHMANN T, K?HLER C, WEIDAUER E, et al. Expression of MRP1 and related transporters in human lung cells in culture[J]. Toxicology, 2001, 167(1): 59-72.

[17] LITMAN T, DRULEY T E, STEIN W D, et al. From MDR to MXR: new understanding of multidrug resistance systems, their properties and clinical significance[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2001, 58(7): 931-959.

[18] NAKAGAMI T, YASUI-FURUKORI N, SAITO M, et al. Effect of verapamil on pharmacokinetics and pharmacodynamics of risperidone: in vivo evidence of involvement of P-glycoprotein in risperidone disposition[J]. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2005, 78(1): 43-51.

[19] QUIRóS A, DáVALOS A, LASUNCIóN M A, et al. Bioavailability of the antihypertensive peptide LHLPLP: transepithelial flux of HLPLP[J]. International Dairy Journal, 2008, 18(3): 279-286.

[20] KARBACH U. Paracellular calcium transport across the small intestine[J]. The Journal of Nutrition, 1992, 122(3): 672-677.

Establishment of Caco-2 Cell Model and Intestinal Absorption Mechanism of the Antihypertensive Peptides Val-Pro-Pro and Ile-Pro-Pro

ZHU Qian1, GUO Yu-xing1,*, PAN Dao-dong1,2, ZENG Xiao-qun2, SUN Yang-ying2, ZHOU Hui-min1
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The Caco-2 cell model, an intestinal endothelial model for transport study, was established to study the absorption mechanism of the antihypertensive peptides, Val-Pro-Pro (VPP) and Ile-Pro-Pro (IPP). The Caco-2 cell model was evaluated by morphological features, transepithelial electrical resistance and the transmittance of fluorescein sodium. We comparatively investigated the effects of transport time, peptide concentration, enhancers and inhibitors on the transport pathways and efflux mechanisms of VPP and IPP. The results showed the established Caco-2 cell model could be used to study the intestinal absorption of VPP and IPP. Paracellular diffusion was suggested to be the main mechanism for the absorption of the two antihypertensive peptides. The transports of both peptides were influenced by the efflux pump. The efflux affected VPP more than IPP. Thus, IPP showed higher bioavailability.

antihypertensive; Val-Pro-Pro; Ile-Pro-Pro; Caco-2 cell; transport

TS252.1

A

1002-6630（2014）15-0226-06

10.7506/spkx1002-6630-201415046

2013-06-24

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101314）；江蘇省自然科學基金項目（BK2011787）；

江蘇省高校自然科學研究項目（13KJB550013）；浙江省自然科學基金項目（LQ12C20003）；

寧波市科技局自然科學基金項目（2012A610145）

祝倩（1989—），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學。E-mail：853281206@qq.com

*通信作者：郭宇星（1981—），女，講師，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：guoyuxing1981@163.com