吳遵秋，姜友軍，蘇光燦，王安逸，陳華萍，楊澤身，黃乾明,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014；2.涼山州中澤新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，四川 西昌 615000）

油橄欖葉中橄欖苦苷的體外抗氧化和抑菌活性

吳遵秋1，姜友軍1，蘇光燦2，王安逸2，陳華萍1，楊澤身2，黃乾明1,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014；2.涼山州中澤新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，四川 西昌 615000）

采用總抗氧化能力法和總還原能力法測(cè)定橄欖苦苷體外抗氧化活性，以濾紙片法考察橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性，稀釋法分析橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響和最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。結(jié)果顯示：橄欖苦苷在0.02～0.08 mg/mL范圍內(nèi)與2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚相比始終表現(xiàn)出強(qiáng)的總抗氧化能力和總還原能力；橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響表現(xiàn)為延緩細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，10 mg/mL時(shí)其抑菌圈直徑d＝（20.77±0.47）mm，為極度敏感，MIC為0.025 mg/mL；金黃色葡萄球菌為高敏感（d＝（19.23±0.44）mm＞15 mm），MIC為0.05 mg/mL；而枯草芽孢桿菌處于中度敏感狀態(tài)（d＝（11.48±0.60） mm＜15 mm），MIC為0.4 mg/mL。結(jié)果表明，橄欖苦苷具有極強(qiáng)的抗氧化和抑菌活性。

油橄欖葉；橄欖苦苷；抗氧化活性；抑菌活性；總還原能力

油橄欖（Olea europaea L.）屬木犀科木犀欖屬，其具有較強(qiáng)的抵抗微生物侵襲能力[1]，可生長(zhǎng)幾百年。油橄欖葉提取物早已被地中海地區(qū)的人們當(dāng)作民間醫(yī)藥來(lái)治療發(fā)燒和其他疾病如瘧疾等[2]。油橄欖葉提取物具有強(qiáng)的抑菌活性并可分離出橄欖苦苷且含量很高[3]。橄欖苦苷是一種無(wú)毒、易被人體吸收[4]的苯酚類(lèi)裂環(huán)環(huán)烯醚帖苷化合物，有清除超氧陰離子自由基（O2-·）、過(guò)氧化氫（H2O2）、NO·和過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO-）的能力[5]，還有抗癌[6-7]、抗血栓[8]、預(yù)防動(dòng)脈硬化和神經(jīng)保護(hù)[9-10]等作用。

我國(guó)油橄欖產(chǎn)業(yè)起步較晚，有關(guān)油橄欖研究較少，國(guó)內(nèi)對(duì)其活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)評(píng)價(jià)橄欖苦苷的體外抗氧化活性和抑菌活性，為油橄欖葉和橄欖苦苷的藥理活性研究、拓寬應(yīng)用途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室保存。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為自制。

2013年3月從西昌油橄欖種植基地采集油橄欖葉，蒸餾水清洗，室內(nèi)自然陰干，50 ℃恒質(zhì)量，粉碎過(guò)40 目篩，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）、硫酸亞鐵（FeSO4）、氯化鐵（FeCl3）均為分析純 成都科龍化學(xué)試劑廠；橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tri（2-pyridinyl）-1,3,5-triazine，TPTZ）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT） 上海晶純生化科技股份有限公司；亞鐵還原能力實(shí)驗(yàn)（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）工作液（0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1（V/V）混合組成，現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2 儀器與設(shè)備

SB-3200D超聲波清洗機(jī)（頻率40 kHz，超聲功率180 W） 寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-10AVP高效液相色譜儀 日本島津公司；UV-2102PCS紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；GHP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；YYQ-SG41-280高壓蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；HZQ-F100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橄欖苦苷提取和純度測(cè)定

參考王成章等[11]提取方法并作改進(jìn)。取油橄欖葉干燥粉末5 g，80%甲醇作為提取溶劑，超聲波提取40 min，提取液經(jīng)抽濾、萃取、濃縮、薄層層析分析、硅膠過(guò)柱、濃縮、真空干燥，制得橄欖苦苷純樣（圖1）。

圖1 橄欖苦苷提取流程Fig.1 Extraction process of oleuropein

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)橄欖苦苷純度進(jìn)行測(cè)定[11]。柱子：ODS-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（40∶60，V/V）；測(cè)定波長(zhǎng)：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：常溫；時(shí)間：45 min。

1.3.2 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.2.1 總抗氧化能力測(cè)定[12-13]

取一定體積橄欖苦苷溶液，加入3 mL FRAP工作液，37 ℃反應(yīng)10 min，于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。將1 mmol/L FeSO4溶液分別稀釋成濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的溶液，各取1 mL加入3 mL FRAP工作液，混勻后37 ℃水浴10 min，測(cè)定A593nm，以FeSO4溶液的濃度為橫坐標(biāo)，A593nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。橄欖苦苷總抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4物質(zhì)的量（mmol）的百分比表示。以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2.2 總還原能力測(cè)定

移取一定體積橄欖苦苷溶液于試管，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），再加入1 mL 1% K3Fe(CN)6溶液，50 ℃溫育20 min，取出冷卻至室溫，加入1 mL 10% TCA溶液，避光靜置10 min，移取2 mL于一空試管中，加入2 mL蒸餾水和0.3 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻靜置10 min于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A1[14]，甲醇代替橄欖苦苷溶液作為空白對(duì)照A0，BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。按照下式計(jì)算總還原能力。

1.3.3 橄欖苦苷抑菌活性

1.3.3.1 抑菌活性測(cè)定

采用濾紙片法[15-16]評(píng)價(jià)橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性。用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待平板凝固后，取100 μL菌懸液（107～108CFU/mL）均勻涂布在培養(yǎng)基表面，靜置30 min后，將吸有10 μL橄欖苦苷溶液的滅菌濾紙圓片（6 mm）貼于涂布好菌液的培養(yǎng)基上同時(shí)以甲醇作為空白對(duì)照，靜置15 min后置于37 ℃培養(yǎng)18 h。觀察并測(cè)量各抑菌圈直徑d（包含濾紙片直徑），記錄抑菌圈直徑大?。╩m）。根據(jù)抑菌圈直徑大小來(lái)判定細(xì)菌對(duì)橄欖苦苷的敏感度（根據(jù)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑d＝6 mm為不敏感，6 mm＜d＜10 mm為低度敏感，10 mm≤d＜15 mm為中度敏感，15 mm≤d＜20 mm為高度敏感，d≥20 mm為極敏感）。細(xì)菌對(duì)橄欖苦苷表現(xiàn)出敏感度越高則橄欖苦苷對(duì)該細(xì)菌具有較好的抑菌效果。

1.3.3.2 橄欖苦苷對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

采用稀釋法[17-18]分析橄欖苦苷對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響，配制質(zhì)量濃度為0.00（甲醇）、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/mL橄欖苦苷溶液，無(wú)菌水為空白對(duì)照。在50 mL三角錐瓶加入5 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后依次加入50 μL菌懸液（104～105CFU/mL）和0.5 mL橄欖苦苷溶液，160 r/min振蕩培養(yǎng)。每一個(gè)質(zhì)量濃度做7 個(gè)培養(yǎng)瓶，分別在培養(yǎng)0、6、12、18、24、30、36 h取出一瓶于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A540nm。繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.3.3.3 最低抑菌濃度測(cè)定

參考錢(qián)森和等[19]方法，稀釋質(zhì)量濃度分別為0.003 125、0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5 mg/mL的橄欖苦苷溶液。在50 mL錐形瓶中加入10 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基滅菌，冷卻后依次加入100 μL菌懸液（104～105CFU/mL）和1 mL不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷溶液，160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A540nm。吸光度為0的培養(yǎng)基中加入的橄欖苦苷質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖苦苷純度分析

配制一定質(zhì)量濃度梯度橄欖苦苷標(biāo)品溶液，經(jīng)HPLC分析，線性回歸方程：Y＝8.424 9×10-7X+0.154 1（R2＝0.999 9），Y為橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量/μg，X為對(duì)應(yīng)的峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%。分析得出橄欖苦苷樣品純度為96.54%。

2.2 橄欖苦苷體外抗氧化活性分析

2.2.1 總抗氧化能力

圖2 橄欖苦苷總抗氧化能力Fig.2 Total antioxidant capacity of oleuropein

在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ可被還原性物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ形式，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，于593 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收峰。在Fe3+-TPTZ過(guò)量的情況下，檢測(cè)藍(lán)色物質(zhì)的生成量可以反映待測(cè)物質(zhì)的總抗氧化能力。如圖2所示，橄欖苦苷總抗氧化能力明顯強(qiáng)于BHT，在0.02～0.08 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)橄欖苦苷和BHT總抗氧化能力與其質(zhì)量濃度成正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)橄欖苦苷抗氧化能力為（52.90±1.58）%，BHT為（48.46±0.03）%。橄欖苦苷總抗氧化能力的IC50為（0.075±0.002）mg/mL，在研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)BHT總抗氧化能力低于50%。

2.2.2 總還原能力

圖3 橄欖苦苷總還原能力Fig.3 Total reducing power of oleuropein

由K3Fe(CN)6反應(yīng)成K4Fe(CN)6，并進(jìn)一步生成Fe4[Fe(CN)6]3，這是一有色反應(yīng)的過(guò)程，在700 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，吸光度越大則樣品的還原力越強(qiáng)。如圖3所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，橄欖苦苷總還原能力為（87.59±0.12）%，BHT為（74.66±3.61）%。橄欖苦苷IC50為（0.014±0.001）mg/mL，BHT的IC50為（0.023±0.003）mg/mL，IC50差值約0.010 mg/mL，表明橄欖苦苷的總還原能力強(qiáng)于BHT。橄欖苦苷比BHT有更強(qiáng)的總抗氧化能力和總還原能力，這可能是因?yàn)榱u基鄰位二取代的結(jié)構(gòu)使其具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和抗氧化活性[20]。

2.3 橄欖苦苷抑菌活性分析

2.3.1 抑菌活性

表1 橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌的抑菌圈大小和細(xì)菌敏感度Table1 Sensitivity and inhibitory zone diameter of three species of bacteria when exposed to oleuropein

橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌的抑菌圈大小和細(xì)菌的敏感程度如表1所示。3 種細(xì)菌對(duì)甲醇表現(xiàn)出不敏感或敏感度不明顯，橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌都有抑菌作用。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌（P＝0.000，F(xiàn)＝167.79），大腸桿菌處于中度敏感（d＝（11.15±0.52）mm＜15 mm），金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌處于低敏感狀態(tài)（d＜10 mm），且二者之間不存在顯著差異（P＝0.104＞0.05）。質(zhì)量濃度為4、6 mg/mL時(shí)大腸桿菌處于高度敏感狀態(tài)（15 mm＜d＜20 mm），金黃色葡萄球菌為中度敏感，而枯草芽孢桿菌為低敏感狀態(tài)，橄欖苦苷對(duì)3 種菌的抑菌效果存在顯著差異（P＝0.000，F(xiàn)＝271.484，F(xiàn)＝238.135），對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯強(qiáng)于枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌之間存在極顯著差異（P＝0.000＜0.01）。在質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，橄欖苦苷對(duì)3 種菌都存在強(qiáng)的抑菌活性，且兩兩之間存在極顯著差異（P＝0.000＜0.01，F(xiàn)＝2 123.808），此時(shí)枯草芽孢桿菌對(duì)橄欖苦苷敏感狀態(tài)處于低度和中度之間（d＝（10.02±0.25） mm）。質(zhì)量濃度達(dá)10 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌有極強(qiáng)的抑菌作用（d＝（20.77±0.47）mm＞20 mm），為極度敏感狀態(tài)，金黃色葡萄球菌仍處于高度敏感狀態(tài)（d＝19.23 mm＜20 mm），而枯草芽孢桿菌對(duì)橄欖苦苷表現(xiàn)為中度敏感，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌（P＝0.000＜0.01，F(xiàn)＝415.578），此時(shí)橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用也存在顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果顯示橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，其次為金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌對(duì)橄欖苦苷表現(xiàn)出敏感度不高。眾所周知，苯酚類(lèi)或抗氧化物通過(guò)與細(xì)胞的肽聚糖作用破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或損害細(xì)胞膜，兩者一起作用抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。由于橄欖苦苷羥基鄰位二取代結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性強(qiáng)，以及大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）細(xì)胞壁肽聚糖含量低和層次少，橄欖苦苷易于進(jìn)入和產(chǎn)生抑制作用。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密，以及芽孢強(qiáng)抗逆性使得橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌的作用較弱。

2.3.2 橄欖苦苷對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

2.3.2.1 橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.4 Effect of oleuropein at different concentrations on the growth curve of Escherichia coli

大腸桿菌在添加不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷培養(yǎng)基中培育36 h的生長(zhǎng)狀況如圖4所示。無(wú)菌水代替橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中細(xì)菌在培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)增長(zhǎng)明顯加快，6～12 h為大腸桿菌的快速生長(zhǎng)期。在以甲醇（0.00 mg/mL）代替橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中大腸桿菌在培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)開(kāi)始增長(zhǎng)，12 h后適應(yīng)環(huán)境并快速繁殖，在12～18 h處于快速生長(zhǎng)期并達(dá)到最大菌液濃度，與無(wú)菌水組比較，此時(shí)細(xì)菌的快速生長(zhǎng)期相對(duì)延緩，說(shuō)明甲醇對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有一定的影響。當(dāng)添加質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL橄欖苦苷溶液時(shí)，培養(yǎng)到18 h后大腸桿菌開(kāi)始增長(zhǎng)，在培養(yǎng)24～30 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。橄欖苦苷質(zhì)量濃度為0.05、0.10 mg/mL時(shí)，在培養(yǎng)24 h后細(xì)菌生長(zhǎng)并快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)30 h后細(xì)菌數(shù)還在增加。在質(zhì)量濃度為0.50、1.00 mg/mL時(shí)，36 h內(nèi)大腸桿菌的生長(zhǎng)完全被抑制，說(shuō)明橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度＜0.50 mg/mL。表明大腸桿菌隨著橄欖苦苷質(zhì)量濃度的增加，快速生長(zhǎng)期被相應(yīng)延緩或推遲，細(xì)菌的生長(zhǎng)周期被相應(yīng)延長(zhǎng)，但是對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率沒(méi)有受到多大影響。

2.3.2.2 橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖5 不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.5 Effect of oleuropein at different concentrations on the growth curve of Staphylococcus aureus

如圖5所示，在添加無(wú)菌水培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)6 h后數(shù)目增加，在培養(yǎng)12 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期，培養(yǎng)18 h附近達(dá)最大吸光度，此后細(xì)菌數(shù)開(kāi)始緩慢降低。甲醇組（0.00 mg/mL）中的細(xì)菌在培養(yǎng)12 h后細(xì)菌數(shù)增加較快，18 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)24 h后達(dá)最大菌液濃度，此時(shí)對(duì)數(shù)期相對(duì)無(wú)菌水組被延緩，說(shuō)明甲醇對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑菌作用。在加有質(zhì)量濃度為0.01、0.05 mg/mL橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18 h后繁殖較快，數(shù)目增加明顯，24 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)30 h后金黃色葡萄球菌數(shù)趨于穩(wěn)定。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)18 h細(xì)菌開(kāi)始適應(yīng)環(huán)境，24 h后進(jìn)行快速生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期出現(xiàn)在培養(yǎng)至24～30 h之間。質(zhì)量濃度為0.50、1.00 mg/mL時(shí)36 h內(nèi)橄欖苦苷完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，此時(shí)生長(zhǎng)曲線為水平狀態(tài)，表明橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度＜0.50 mg/mL。橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響同樣表現(xiàn)在對(duì)細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的延緩。

2.3.2.3 橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.6 Effect of oleuropein at different concentrations on the growth curve of Bacillus subtilis

由圖6可知，無(wú)菌水組和甲醇組的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線趨于一致，在培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)開(kāi)始增長(zhǎng)，6～12 h處于快速生長(zhǎng)期，此后細(xì)菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定并開(kāi)始降低，說(shuō)明甲醇對(duì)枯草芽孢桿菌影響不大或沒(méi)有抑制作用。當(dāng)橄欖苦苷質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌的快速生長(zhǎng)被延緩到12～24 h，此時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被延緩，細(xì)菌生長(zhǎng)速率減慢且所需時(shí)間范圍變大。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加，于18～24 h達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。橄欖苦苷質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí)，36 h內(nèi)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)被完全抑制，表明橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度＜1.00 mg/mL。橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響表現(xiàn)在細(xì)菌數(shù)開(kāi)始增加到進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和菌液濃度達(dá)最大所需的時(shí)間范圍被延長(zhǎng)，主要還是表現(xiàn)為對(duì)快速生長(zhǎng)時(shí)期的抑制作用。

表2 不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷培養(yǎng)基中3 種細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的相對(duì)延緩時(shí)間Table2 Relative delay time for the logarithmic phase of three species of bacteria in the presence of oleuropein at various concentrations

分別以無(wú)菌水和甲醇作為對(duì)照，比較不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響，結(jié)果如表2所示，甲醇對(duì)枯草芽孢桿菌的影響很小或沒(méi)有抑制作用，甲醇對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，但是在抑菌圈測(cè)試中，這種作用不明顯，可能是甲醇量少、易揮發(fā)以及橄欖苦苷在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散效果不好，且微溶于水所致。無(wú)論以無(wú)菌水還是甲醇作為對(duì)照，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效果最佳，對(duì)數(shù)期被延緩18、12 h。橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果其次，在0.01、0.05 mg/mL質(zhì)量濃度時(shí)，金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期被延緩12 h，質(zhì)量濃度達(dá)0.10 mg/mL時(shí)被延緩18 h，以甲醇為對(duì)照被延緩12 h。橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制效果相對(duì)較弱，在0.01～0.10 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，橄欖苦苷對(duì)其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期都延緩6 h，在質(zhì)量濃度0.50 mg/mL時(shí)被延緩12 h。橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度范圍分別為＜0.50 mg/mL、＜0.50 mg/mL、＜1.00 mg/mL。

2.3.3 最低抑菌濃度分析

圖7 橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌的最低抑菌濃度曲線Fig.7 Minimum inhibitory concentration curves of oleuropein against three species of bacteria

采用稀釋法分析橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度（圖7），在質(zhì)量濃度＜0.2 mg/mL時(shí)，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用較強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用較弱。當(dāng)橄欖苦苷質(zhì)量濃度≥0.025 mg/mL時(shí)，大腸桿菌吸光度趨為零，因此橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.025 mg/mL；當(dāng)橄欖苦苷質(zhì)量濃度≥0.05 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌沒(méi)有生長(zhǎng)，MIC為0.05 mg/mL。有研究報(bào)道[21]橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.0312～0.125 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合；枯草芽孢桿菌隨橄欖苦苷質(zhì)量濃度的增加細(xì)菌數(shù)減少、生長(zhǎng)減慢，在質(zhì)量濃度＞0.1 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)液的吸光度迅速降低，此時(shí)橄欖苦苷濃度細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)被完全抑制，此為其最低抑菌濃度。

3 結(jié) 論

橄欖苦苷體外抗氧化和抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：橄欖苦苷具有強(qiáng)的體外抗氧化活性和抑菌作用。在0.02～0.08 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與BHT相比較，橄欖苦苷表現(xiàn)出強(qiáng)的總抗氧化能力和總還原能力，總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果表明，橄欖苦苷的IC50為（0.075±0.002）mg/mL，而此時(shí)BHT的抗氧化率低于50%；總還原能力測(cè)定結(jié)果表明，橄欖苦苷的IC50為（0.014±0.001）mg/mL，BHT的IC50為（0.023±0.003）mg/mL，差值為0.010 mg/mL。在所研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)（20.77±0.47）mm，MIC為0.025 mg/mL；金黃色葡萄球菌對(duì)橄欖苦苷表現(xiàn)出高度敏感（d＝（19.23±0.44）mm），MIC為0.05 mg/mL；而橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用相對(duì)較弱，處于中度敏感狀態(tài)，MIC為0.4 mg/mL。橄欖苦苷對(duì)3 種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響表現(xiàn)在對(duì)其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的延緩。對(duì)大腸桿菌的抑制作用極顯著強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌（P＜0.01），金黃色葡萄球菌對(duì)橄欖苦苷的敏感度高于枯草芽孢桿菌（P＜0.05）。這為橄欖苦苷在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和研究提供了參考。

[1] KESKIN D, CEYHAN N, U?UR A, et al. Antimicrobial activity and chemical constitutions of West Anatolian olive (Olea europaea L.) leaves[J]. Journal of Food, Agriculture & Environment, 2012, 10(2): 99-102.

[2] SIFAOUI I, LóPEZ-ARENCIBIA A, MARTíN-NAVARRO C M, et al. Activity assessment of Tunisian olive leaf extracts against the trophozoite stage of Acanthamoeba[J]. Parasitology Research, 2013, 112(8): 2825-2829.

[3] KORUKLUOGLU M, SAHAN Y, YIGIT A, et al. Antibacterial activity and chemical constitutions of Olea europaea L. leaf extracts[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2010, 34(3): 383-396.

[4] TAN Haiwei, TUCK K L, STUPANS I, et al. Simultaneous determination of oleuropein and hydroxytyrosol in rat plasma using liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography B, 2003, 785(1): 187-191.

[5] CZERWI?SKA M, KISS A K, NARUSZEWICZ M. A comparison of antioxidant activities of oleuropein and its dialdehydic derivative from olive oil, oleacein[J]. Food Chemistry, 2012, 131(3): 940-947.

[6] BULOTTA S, CORRADINO R, CELANO M, et al. Antiproliferative and antioxidant effects on breast cancer cells of oleuropein and its semisynthetic peracetylated derivatives[J]. Food Chemistry, 2011, 127(4): 1609-1614.

[7] BULOTTA S, CORRADINO R, CELANO M, et al. Antioxidant and anti-growth action of peracetylated oleuropein in thyroid cancer cells[J]. Journal of Molecular Endocrinology, 2013, 51(1): 181-189.

[8] DUB A M, DUGANI A M. Antithrombotic effect of repeated doses of the ethanolic extract of local olive (Olea europaea L.) leaves in rabbits[J]. The Libyan Journal of Medicine, 2013, 8(1): 1-6.

[9] URPI-SARDA M, CASAS R, CHIVA-BLANCH G, et al. Virgin olive oil and nuts as key foods of the Mediterranean diet effects on inf l ammatory biomarkers related to atherosclerosis[J]. Pharmacological Research, 2012, 65(6): 577-583.

[10] MOHAGHEGHI F, BIGDELI M R, RASOULIAN B, et al. The neuroprotective effect of olive leaf extract is related to improved blood-brain barrier permeability and brain edema in rat with experimental focal cerebral ischemia[J]. Phytomedicine, 2011, 18(2): 170-175.

[11] 王成章, 高彩霞, 葉建中, 等. 引種阿斯油橄欖葉中橄欖苦苷提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2009, 29(3): 53-57.

[12] 劉蕓, 仇農(nóng)學(xué), 楊璽玉. 葡萄皮渣提取物總酚含量及體外抗氧化活性、抑菌活性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(1): 5-9.

[13] CáRCEL J A, GARCíA-PéREZ J V, MULET A, et al. Ultrasonically assisted antioxidant extraction from grape stalks and olive leaves[J]. Physics Procedia, 2010, 3(1): 147-152.

[14] SABEENA FARVIN K, ANDERSEN L L, NIELSEN H H, et al. Antioxidant activity of Cod (Gadus morhua) protein hydrolysates: in vitro assays and evaluation in 5% fi sh oil-in-water emulsion[J]. Food Chemistry, 2013, 149(3): 326-334.

[15] 王元清, 嚴(yán)建業(yè), 喻林華, 等. 玉米須提取物抑菌活性及耐熱耐壓穩(wěn)定性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 23(4): 308-309.

[16] 孫藝方, 杜利利, 周樂(lè), 等. 紫花地丁抗菌活性成分研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(19): 2666-2671.

[17] 楊鵬斌, 于新. 綠色木霉菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用[J].食品科學(xué), 2012, 33(19): 25-28.

[18] 吳朝霞, 金楠, 張敏, 等. 胡桃醌抑制細(xì)菌生長(zhǎng)作用的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(6): 131-134.

[19] 錢(qián)森和, 厲榮玉, 魏明, 等. 普通念珠藻多糖提取及其體外抑菌活性研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(6): 96-99.

[20] TRIPOLI E, GIAMMANCO M, TABACCHI G, et al. The phenolic compounds of olive oil: structure, biological activity and benef i cial effects on human health[J]. Nutrition Research Reviews, 2005, 18(1): 98-112.

[21] BISIGNANO G, TOMAINO A, CASCIO R L, et al. On the in vitro antimicrobial activity of oleuropein and hydroxytyrosol[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1999, 51(8): 971-974.

Antioxidant and Antimicrobial Activities of Oleuropein in vitro

WU Zun-qiu1, JIANG You-jun1, SU Guang-can2, WANG An-yi2, CHEN Hua-ping1, YANG Ze-shen2, HUANG Qian-ming1,*
(1. College of Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Liangshan Zhongze New Technology Development Co. Ltd., Xichang 615000, China)

The purpose of this study was to evaluate the antioxidant and antibacterial activities of oleuropein from olive leaves. The antioxidant activity in vitro was analyzed by total antioxidant capacity and total reducing power. Filter paper disc method was used to determine the antibacterial activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. Dilution method was used to analyze the effects of oleuropein on bacterial growth curves for determining the minimum inhibitory concentrations (MIC). The results showed that oleuropein exhibited stronger total antioxidant capacity and reducing power than BHT in the concentration range of 0.02-0.08 mg/mL. Oleuropein had inhibitory effect on the three species of bacteria, and the logarithmic growth phases of the bacteria were correspondingly delayed with increasing concentration. Oleuropein had the strongest inhibitory effect on Escherichia coli, with an inhibitory zone diameter (d) of (20.77±0.47) mm and MIC of 0.025 mg/mL. Staphylococcus aureus revealed high sensitivity (d ＝ (19.23 ± 0.44) mm ＞ 15 mm) with MIC of 0.05 mg/mL. However, Bacillus subtilis had moderate sensitivity (d ＝ (11.48 ± 0.60) mm ＜ 15 mm), with MIC of 0.4 mg/mL. These results conf i rmed that oleuropein had strong antioxidant and antibacterial activities.

olive leave; oleuropein; antioxidant activity; antimicrobial activity; total reducing power

TS201.2

A

1002-6630（2014）21-0094-06

10.7506/spkx1002-6630-201421019

2014-01-17

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（12ZC2220）

吳遵秋（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：wuzunqiu1988@126.com

*通信作者：黃乾明（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：hqming@sicau.edu.cn