楊曉雁，袁春龍*，張 暉，楊 健，張世杰，馬 婧，楊 麗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

酒度、總酸、pH值以及飲用溫度對(duì)干紅葡萄酒澀味的影響

楊曉雁，袁春龍*，張 暉，楊 健，張世杰，馬 婧，楊 麗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析唾液蛋白與模擬酒反應(yīng)后蛋白減少比例，并將其表示為澀味強(qiáng)度；同時(shí)，以酒度、總酸、pH值以及飲用溫度為考察因素，利用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)分析各因子對(duì)澀味強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：pH值對(duì)澀度影響最大，其次是酸度和溫度，酒度影響最??；其中pH值和酸度互作效應(yīng)對(duì)澀味的影響顯著。

模擬酒；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；澀味強(qiáng)度；唾液蛋白沉淀指數(shù)

紅葡萄酒的澀味是由于酒中的多酚與口腔唾液蛋白結(jié)合，形成可溶復(fù)合物或沉淀物，從而對(duì)口腔表皮細(xì)胞產(chǎn)生的收斂緊縮感[1]。口腔中可以在沒有味覺接收器的部位感受到澀味的產(chǎn)生，所以通常認(rèn)為澀味是一種觸覺感受而非味覺刺激[2]。對(duì)于多數(shù)佐餐酒來說，單寧具有維持酒體結(jié)構(gòu)，增加復(fù)雜性和味覺長度的作用，單寧引起的澀味強(qiáng)度是評(píng)價(jià)干紅葡萄酒口感很重要的依據(jù)之一[3]。

紅葡萄酒澀味強(qiáng)度與很多因素有關(guān)，如單寧結(jié)構(gòu)、唾液蛋白種類與數(shù)量以及葡萄酒基質(zhì)條件等。單寧分子質(zhì)量大，立體結(jié)構(gòu)較為疏散，結(jié)合蛋白效率高，如以C4～C8鍵結(jié)合的單寧整體結(jié)構(gòu)比C4～C6的更線性，結(jié)合能力更強(qiáng)，澀味強(qiáng)度更大[4]。唾液蛋白不同成分與單寧的結(jié)合效率也不同[5]，蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在唾液中鑒別出437 種蛋白，而與澀味有關(guān)的蛋白，主要是富脯蛋白（proline-rich proteins，PRPs），富組蛋白（histidinerich proteis，HRP），胱蛋白酶抑制劑，乳鐵蛋白和α-淀粉酶，其中富脯蛋白，富組蛋白以及α-淀粉酶對(duì)澀味貢獻(xiàn)最大[6-7]。除上述因素，影響葡萄酒澀味的還有酒度、總酸、pH值、溫度、殘?zhí)?、黏度、酒體氧化程度以及品嘗員個(gè)體的差異等[8-9]，都對(duì)葡萄酒澀味評(píng)價(jià)有一定程度的影響。

葡萄酒澀味測定的傳統(tǒng)方法是通過人體感官品嘗來實(shí)現(xiàn)，然而感官分析本身存在很多不足之處：由于個(gè)人體質(zhì)的差異會(huì)對(duì)澀味有不同的敏感性[10]；葡萄酒中存在酸味苦味等復(fù)雜的口感都會(huì)對(duì)澀味有干擾作用；感官品嘗澀味還容易導(dǎo)致口腔疲勞，不易精確感知；酒精灼熱感對(duì)澀味感受也有一定干擾作用。另外由于紅酒中的苦澀味彼此之間會(huì)發(fā)生不良味感的疊加，不易區(qū)分苦澀。鑒于上述原因，要對(duì)葡萄酒澀味進(jìn)行評(píng)價(jià)確實(shí)存在一定難度，所以近年來在體外評(píng)價(jià)澀味的研究受到很多關(guān)注。在不同學(xué)者提出的多種方法中，使用最為廣泛的是聚丙烯酰胺凝膠電泳[8,10]。

本實(shí)驗(yàn)通過建立感官品嘗與化學(xué)分析方法相關(guān)關(guān)系，確定體外研究方法后，利用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，重點(diǎn)探討酒度、總酸、pH值以及飲用溫度對(duì)葡萄酒澀味的影響，以及影響因素之間的互作效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

酒石酸 天津博迪試劑公司；明礬（硫酸鋁鉀）、氫氧化鈉、無水乙醇 天津科密歐公司；兒茶素、牛血清白蛋白 美國Sigma公司；三羥基三乙胺（簡稱三乙醇胺，即triethanolamine（TEA））、氯化鐵、蘆丁、甲醇、氯化鋁、亞硝酸鈉等藥品均為分析純天津光復(fù)試劑公司；Tris-HCl（pH 6.8）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、四乙基乙二胺（N,N,N’,N’-tetraethylethylenediamine，TEMED）原液、10%過硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）、pH 8.6 Tris-甘氨酸電極緩沖液、0.02%溴酚藍(lán)、β-巰基乙醇 北京博沃森試劑公司。

DYY-10C電泳儀、DYC2-24DN垂直電泳槽 北京市六一儀器廠；TS-1000脫色搖床 上海西工儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 模擬酒的配制

根據(jù)干紅葡萄酒相關(guān)理化指標(biāo)，配制模擬酒，以3 g/L單寧酸為基礎(chǔ)，選擇酒度梯度為0%、7%～11%、13%、15%（V/V），總酸梯度為0、1、2、4、6 g/L、pH值梯度為 2.5、3.0、3.7、4.0、4.5和飲用溫度梯度為10、18、25、37、45 ℃，用0.45 μm過濾器將配制好的模擬酒進(jìn)行過濾，室溫保存待用，做單因素試驗(yàn)以及四因素五水平的正交試驗(yàn)。

1.2.2 酒樣的準(zhǔn)備

抽選10 款實(shí)驗(yàn)用酒樣包括山西鄉(xiāng)寧戎子酒莊2012年品麗珠以及赤霞珠；內(nèi)蒙古烏海漢森酒莊2008年蛇龍珠和赤霞珠；新疆沙地酒莊2011和2012年赤霞珠；河北昌黎朗格斯酒莊2009和2011年美樂、馬瑟蘭以及馬爾貝克混釀；寧夏賀蘭山酒莊2012年美樂；甘肅嘉峪關(guān)紫軒酒莊2010年美樂。

1.2.3 唾液蛋白的制備

選取6 名無口腔疾病不吸煙的志愿者，3男3女，上午10點(diǎn)—11點(diǎn)收集唾液，在收集之前2 h內(nèi)不吃東西。將唾液收集到冷凍5 min的離心管中，靜置過夜后在10 000×g條件下離心10 min，除去不溶物質(zhì)，所得上清液為唾液蛋白樣品。

1.2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

取50 μL模擬酒樣與100 μL唾液蛋白反應(yīng)5 min，然后10 000×g離心10 min，取上清溶液再進(jìn)行SDS-PAGE。

取唾液蛋白原液作為參照，與模擬酒結(jié)合后的蛋白溶液作為上樣蛋白，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。分別配制12.5%的分離膠和4%的濃縮膠，開80 V電泳0.5 h，至溴酚藍(lán)剛跑出濃縮膠，將電壓換到120 V、1.5 h后，即可停止。電泳之后，凝膠在考馬斯亮藍(lán)溶液中進(jìn)行染色過夜后用脫色液孵育脫色，直到凝膠背景色接近無色為止。

利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集電泳條帶圖像信息，Quantity One（Bio-Rad，Version 4.6.2）分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)電泳條帶除背景，進(jìn)行高斯建模，分析蛋白與模擬酒反應(yīng)前后蛋白條帶密度減少量，表達(dá)為唾液蛋白沉降指數(shù)（saliva precipitate index，SPI），用來表示澀度。

1.2.5 葡萄酒多酚指標(biāo)測定

參照Harbertson等[11]單寧-蛋白沉淀法測定干紅葡萄酒中單寧與多酚含量。準(zhǔn)確量取50 g SDS于燒杯中，加50 mL TEA，溶于去離子水中，pH值調(diào)為9.4后定容到1 L，標(biāo)記為Buffer，室溫保存。配制FeCl3-HCl溶液，準(zhǔn)確量取0.676 g氯化鐵，加入200 μL濃鹽酸，定容到250 mL。配制1 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃低溫保存。

兒茶素質(zhì)量濃度梯度范圍為0.05～3 mg/mL，510 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定過程為取少許酒樣，加入1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，反應(yīng)15 min后，13 500×g離心5 min；棄去上清液，加入875 μL Buffer靜置10 min，510 nm波長處測定A1。繼續(xù)加入125 μL 三氯化鐵溶液，10 min后510 nm波長處測定A2。按照公式（1）計(jì)算單寧含量。其結(jié)果用兒茶素當(dāng)量表示。

式中：b、k分別為標(biāo)線截距和斜率。

式中：A總酚為總酚的吸光度；A0為875 μL Buffer + 125 μL三氯化鐵溶液的吸光度。

根據(jù)Jia Zhishen等[12]蘆丁甲醇法測定酒樣類黃酮。取0.1 mL酒樣，依次加入0.9 mL無水甲醇、30%甲醇溶液 2.7 mL、0.5 mol/L的亞硝酸鈉溶液0.2 mL、 0.3 mol/L氯化鋁溶液0.2 mL，振蕩搖勻后靜置5 min，最后加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液 1 mL，搖勻并在510 nm波長處測定吸光度。樣品重復(fù)3 次，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量表示（mg/L）。

1.2.6 感官培訓(xùn)

感官品嘗小組成員由12～15 名接受過專業(yè)感官培訓(xùn)的學(xué)生及老師組成，年齡在20～36 歲之間。首先，選取2 g/L明礬溶液，0.1 g/L硫酸奎寧溶液，4 g/L酒石酸溶液分別訓(xùn)練識(shí)別澀味、苦味和酸味。品嘗員將液體倒入口中至少保持8 s吐出，描述感受，兩樣品間需要充分休息，多次漱口或咀嚼無味蘇打餅干，使味覺恢復(fù)。然后利用線性標(biāo)記法[13]（即在一條100 mm的線段上，根據(jù)品嘗結(jié)果在線上標(biāo)出感受到的強(qiáng)度，規(guī)定不添加任何物質(zhì)的水溶液強(qiáng)度為零，對(duì)明礬溶液而言2.0 g/L為澀度最強(qiáng)，澀味強(qiáng)度標(biāo)記到100，最后根據(jù)所標(biāo)記位置與原點(diǎn)距離長短定義強(qiáng)度大小），對(duì)質(zhì)量濃度梯度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的明礬標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行反復(fù)線性定位，討論后確定澀味強(qiáng)度在直線上大致的位置。對(duì)不同溶液進(jìn)行澀味定量分析時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液為參照對(duì)象，在直線上標(biāo)出位置，確定其澀味強(qiáng)度。在測試樣品時(shí)，做3 次重復(fù)。

1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)葡萄酒各理化指標(biāo)，以及單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酒度、總酸、pH值和溫度四因素的考察水平。用DPS7.55軟件進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法評(píng)價(jià)澀味相關(guān)性

表1 不同方法對(duì)澀味相關(guān)性的評(píng)價(jià)分析Table1 Correlation analysis

測定葡萄酒中總酚、單寧以及類黃酮等多酚指標(biāo)，建立與感官分析相關(guān)性。利用SPSS17.0分析感官評(píng)價(jià)的澀味強(qiáng)度和電泳分析SPI的Pearson相關(guān)性，結(jié)果如表1所示。單寧含量與感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯著相關(guān)，電泳分析結(jié)果極顯著相關(guān)，其他指標(biāo)與感官評(píng)價(jià)相關(guān)性較差。

發(fā)送端3種狀態(tài)中均對(duì)應(yīng)著同步機(jī)制,CGS狀態(tài)對(duì)應(yīng)碼組(字節(jié))同步,ILAS狀態(tài)對(duì)應(yīng)初始通道同步,DATA狀態(tài)則對(duì)應(yīng)用戶數(shù)據(jù)傳輸過程中的幀/多幀同步。其中sync信號(hào)是接收端反饋給發(fā)送端的關(guān)于同步完成的指示信號(hào)。

2.2 SDS-PAGE分析

電泳結(jié)果利用Quantity One進(jìn)行分析，選擇分子質(zhì)量靠近Marker 66.2、31、22、14.4 kD的4個(gè)主要蛋白作為分析蛋白[14]。由于對(duì)葡萄酒澀味起主要作用的蛋白是富脯蛋白和α-淀粉酶，這兩類蛋白分別在15 kD和62～59 kD附近，在早期研究中，常用這兩種蛋白代表全部的人類唾液蛋白[15]，可見其重要性。

圖1 單因素試驗(yàn)電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis maps

由圖1可知，酒度為0%～15%，pH 2.5～4.5，溫度10～45 ℃等因素梯度作用，結(jié)果蛋白灰度呈現(xiàn)增加趨勢，總酸質(zhì)量濃度0～6 g/L，蛋白灰度呈降低趨勢。因此因素梯度水平能夠引起蛋白含量發(fā)生顯著變化，可用此梯度范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)作進(jìn)一步的分析。

2.3 建立澀味回歸模型

Quantity One數(shù)據(jù)分析后，獲得各因素對(duì)紅葡萄酒中澀味影響的試驗(yàn)結(jié)果，利用DPS7.55對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2）進(jìn)行擬合，獲得以下回歸方程：

表2 二次正交旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal rotation combination design and results

2.4 二次回歸模型顯著性分析

由表3可知，模擬酒中澀度回歸方程的回歸性P=0.000 2＜0.01，說明回歸方程的回歸性水平極顯著。對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，在α=0.1顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后可以得到優(yōu)化方程為：Y= 85.883 3-4.419 17X2-

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal rotation combination design

2.5 單因素與雙因素效應(yīng)結(jié)果

分析酒度、總酸、pH值和溫度4 個(gè)單因素在不同研究水平下對(duì)SPI的影響，可以通過規(guī)定其他3 個(gè)因素置于零水平而得到另一因素對(duì)澀味強(qiáng)度的影響規(guī)律，結(jié)果見圖2。

圖2 各因素與澀味的關(guān)系Fig.2 Relationship between each variable and astringency

由圖2可知，總酸對(duì)澀度的影響呈現(xiàn)開口向下的拋物線趨勢，隨著總酸增加，澀度先緩慢升高后，較大幅度降低。pH值對(duì)澀味強(qiáng)度影響與總酸相近，也存在極大值，隨著pH值升高，澀味強(qiáng)度先迅速增大后緩慢下降。酒度對(duì)澀度的影響不太明顯，幾乎持平。溫度升高，澀度增加，但增加趨勢表現(xiàn)平緩，斜率絕對(duì)值較小。

由表3可知，雙因素間X1X2、X1X3、X1X4、X2X4和X3X4的P值都大于0.05，只有X2X3的P值小于0.05，即表示總酸和pH值間的交互作用比較顯著，而其他因素間的交互作用都不顯著，因此，雙因素間的互交作用不明顯。

3 討 論

通過分析不同總酸、pH值、酒度和溫度對(duì)干紅葡萄酒澀味強(qiáng)度的影響，pH值改變對(duì)澀味強(qiáng)度作用較大，此結(jié)論與Fontoin[16]和Lawless[17]等的結(jié)論一致。pH值體現(xiàn)的是酒體中游離氫離子水平，在酸性環(huán)境中唾液蛋白結(jié)構(gòu)改變，暴露出更多的多酚結(jié)合點(diǎn)，所以二者結(jié)合效率提高[18]，澀味強(qiáng)度從而增大。pH值較低時(shí)，氫鍵結(jié)合還會(huì)促進(jìn)單寧自身結(jié)合，而形成類似蛋白-單寧復(fù)合物，也會(huì)增加口腔中的澀味[19]。另外，氫離子濃度高，多酚物質(zhì)通過疏水作用可以在蛋白表面形成一層膜，使之親水性降低，從而產(chǎn)生多酚-蛋白復(fù)合物。酒體pH值較高時(shí)，帶電的酚鹽離子比例高，帶電物質(zhì)不能參與氫鍵的形成，由于多酚與蛋白結(jié)合主要依靠氫鍵和疏水作用力，因此二者結(jié)合比例降低[20]。對(duì)于干紅葡萄酒而言，酸性物質(zhì)主要是酒石酸，還有少量蘋果酸和檸檬酸。酸性物質(zhì)本身帶有一定澀味，濃度增大時(shí)，自身澀味與單寧澀味相互疊加，從而對(duì)葡萄酒整體澀味存在一定促進(jìn)作用[21]。在葡萄酒中添加有機(jī)酸和無機(jī)酸對(duì)澀味都有促進(jìn)作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)總酸會(huì)促進(jìn)葡萄酒澀味的體現(xiàn)。研究表明，乙醇會(huì)修飾蛋白折疊，可能會(huì)引發(fā)蛋白構(gòu)象改變，從而干擾蛋白與多酚的反應(yīng)，所以乙醇有助于柔化多酚澀味[22-23]。但本實(shí)驗(yàn)中沒有明顯的升降趨勢，可能是由于在模擬酒中成分較為簡單，對(duì)多酚和蛋白作用較弱。最后，從熱力學(xué)角度分析，溫度增加、離子強(qiáng)度增加能夠促進(jìn)疏水作用力[24]。增加溫度會(huì)打開蛋白肽鏈，蛋白表面的疏水面暴露比例增加，促進(jìn)多酚結(jié)合到蛋白表面[25]。溫度越低，酒的澀味越重，香氣更收斂，而低溫有助于多酚的表現(xiàn)力，增加其苦澀味，但溫度的升高會(huì)加快葡萄酒的氧化反應(yīng)，使口感變得圓潤和柔和[26-27]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)唾液蛋白中分子質(zhì)量大小不同對(duì)蛋白多肽進(jìn)行分離，不同多肽對(duì)多酚親和力各異，分別分析其減少比例，進(jìn)而描述澀味。而早期用牛血清白蛋白做為結(jié)合多酚的標(biāo)準(zhǔn)蛋白物質(zhì)[28-29]，但特異性不如唾液蛋白。在體外研究澀味的不同方法中，對(duì)唾液蛋白進(jìn)行SDS-PAGE可以更為真實(shí)地反映出口腔對(duì)澀味的感受。

本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)干紅葡萄酒在體外進(jìn)行澀味評(píng)價(jià)，建立與感官評(píng)價(jià)的相關(guān)關(guān)系，從而進(jìn)一步利用模擬酒來探討葡萄酒條件對(duì)澀味的影響，首次將SDS-PAGE分析方法與二次正交旋轉(zhuǎn)回歸方法結(jié)合，對(duì)葡萄酒澀味影響因素進(jìn)行綜合探討，期望在釀酒過程中通過調(diào)節(jié)葡萄酒某些指標(biāo)來改善口感提高質(zhì)量，并為以后進(jìn)一步的研究提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

根據(jù)二次正交旋轉(zhuǎn)回歸的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，可以得到pH值、總酸、溫度、酒度4個(gè)因素對(duì)葡萄酒澀味強(qiáng)度的回歸方程：Y=85.883 3-1.446 67X1-4.419 17X2+該模型中的pH值和總酸影響效應(yīng)達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），而酒度和溫度的影響效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。并且可以從各因素對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)的絕對(duì)值可推測對(duì)澀味的影響次序?yàn)閜H值＞總酸＞溫度＞酒度，即pH值對(duì)酒中澀味的影響最大，其次是總酸和溫度，對(duì)澀味影響最小的是酒度。干紅葡萄酒中基質(zhì)條件之間的相互作用而導(dǎo)致澀味強(qiáng)度發(fā)生改變，利用SDSPAGE體外定量對(duì)葡萄酒的澀味進(jìn)行測定，對(duì)于客觀評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量有重要的參考意義。

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Effects of Ethanol, Total Acid, pH and Drinking Temperature on the Astringency of Dry Red Wine

YANG Xiao-yan, YUAN Chun-long*, ZHANG Hui, YANG Jian, ZHANG Shi-jie, MA Jing, YANG Li
(College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Astringency is a complex sensation mainly caused by the precipitation of salivary proteins with polyphenols. In wine, astringency can be enhanced or reduced depending on the compositions of the medium. Reduced proportion of human saliva protein after reaction with model wine was evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE), and expressed as astringency intensity. Furthermore, the effects of three parameters including ethanol, total acid, pH, and drinking temperature on astringency intensity were studied by quadratic orthogonal rotation combination analysis. The results showed that pH had the greatest inf l uence on astringency, followed by total acid and temperature, while ethanol had little impact on astringency. The effect of interaction between pH and total acid was signif i cant.

model wine; sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); astringency intensity; saliva precipitation index

TS26

A

1002-6630（2014）21-0118-06

10.7506/spkx1002-6630-201421023

2013-11-18

西北農(nóng)林科技大學(xué)科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2013017）

楊曉雁（1988—），女，碩士，研究方向?yàn)槠咸丫苹瘜W(xué)。E-mail：yang295801145@163.com

*通信作者：袁春龍（1969—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槠咸丫苹瘜W(xué)。E-mail：yuanchl69@nwsuaf.edu.cn