生物共代謝法降解石油污染土壤中的萘、菲*

楊智臨 陳海 白智勇 李博 楊琦

中國地質(zhì)大學(xué)（北京）水資源與環(huán)境學(xué)院

利用從石油污染土壤中篩選分離出的專一性降解萘菌株Rhodococcus（紅球菌屬）與菲菌株Nocardioides（類諾卡氏菌屬）對萘、菲進(jìn)行共代謝降解研究。以菲為共代謝基質(zhì)萘降解菌降解萘的最佳菲初始投加量為0.064mg/L，最佳溫度為35℃；以萘為共代謝基質(zhì)菲降解菌降解菲的最佳萘初始投加量為7.16mg/L，最佳降解溫度為25℃。在本實(shí)驗范圍內(nèi)以菲為共代謝基質(zhì)萘降解菌降解萘的最高去除率達(dá)到86%；以萘為共代謝基質(zhì)菲降解菌降解菲的最高去除率為42%。

共代謝；萘；菲；實(shí)驗；降解

隨著工業(yè)的發(fā)展，萘、菲造成的環(huán)境污染問題也越發(fā)明顯，其中，萘在油田污水中廣泛存在，是油田污水的特征污染物之一，某油田石油污水中曾檢出多達(dá)數(shù)十種萘及萘系化合物。菲比萘有更強(qiáng)的毒性，近年來在環(huán)境和生物體內(nèi)的檢出率非常高。利用從石油污染土壤中篩選分離出的專一性降解萘菌株Rhodococcus（紅球菌屬）與菲菌株Nocardioides（類諾卡氏菌屬）對萘、菲進(jìn)行共代謝降解研究。

1 實(shí)驗材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器

儀器：立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，潔凈工作臺，恒溫水浴振蕩器，分光光度計，高速冷凍離心機(jī)，液相色譜儀等。

材料試劑：萘、菲（J&KCHEMICA）、牛肉膏、蛋白胨等。

1.2 萘、菲的檢測方法

萘、菲濃度以高效液相色譜測定，色譜柱為C—18反相色譜柱，λ=254nm，流動相為甲醇∶水=90∶10，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL。

1.3 萘、菲降解菌的富集培養(yǎng)

將從石油污染土壤中篩選出的萘（菲）降解菌接種于滅菌后的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，添加一定量的固體萘（菲）作為唯一碳源，接種后將錐形瓶放入溫度為30℃的恒溫振蕩器中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 萘、菲互為共代謝基質(zhì)的降解實(shí)驗

降解實(shí)驗在250mL血清瓶中進(jìn)行，取218mL滅菌后的無機(jī)鹽溶液倒入血清瓶中，并分別加入不同量的萘、菲，迅速將瓶塞塞上，用封口膜封住，搖勻，放入水浴振蕩器12h并混勻。

2 實(shí)驗結(jié)果與分析

2.1 以菲為共代謝基質(zhì)降解萘菌對萘的降解

（1）不同濃度菲共代謝基質(zhì)下降解萘菌對同一濃度萘的降解。初始條件：萘的初始濃度為7mg/L，溫度為30℃，初始值pH值為7，菌懸液接種量為1%，轉(zhuǎn)速為150r/min。從不同菲基質(zhì)濃度下萘降解菌對同一濃度萘的降解曲線可看出，在0.064mg/L時，菌種對萘的去除效果最好，去除率為67%；而在濃度為0.1～0.6mg/L之間菌種對萘的去除略差，對萘的去除率約為60%，從總體上來講，菲的加入抑制了菌種對萘的降解。

（2）以菲為共代謝基質(zhì)在不同溫度條件下降解萘菌對同一濃度萘的降解。初始條件：萘的初始濃度為7mg/L，pH值為7，菲的初始濃度為0.1mg/L，菌懸液接種量為1%，轉(zhuǎn)速為150r/min。從以菲為共代謝基質(zhì)、在不同溫度條件下降解萘菌對同一濃度萘的降解曲線可看出，隨溫度的升高，菌種對萘的降解效果逐漸明顯，說明在一定的范圍內(nèi)，溫度的升高對細(xì)菌體內(nèi)酶的活性有提高作用，加快了降解萘的反應(yīng)過程；在35℃時降解效果最好，去除率為61%。

2.2 以萘為共代謝基質(zhì)降解菲菌對菲的降解

（1）不同濃度萘共代謝基質(zhì)下降解菲菌對同一濃度菲的降解。初始條件：菲的初始濃度為0.55mg/L，溫度為30℃，初始pH值為7，菌懸液接種量為1%，轉(zhuǎn)速為150r/min。從不同萘基質(zhì)濃度下降解菲菌對同一濃度菲的降解曲線可看出，隨著萘的濃度升高，菌種對菲的降解程度呈現(xiàn)變大趨勢，這說明萘的加入對菌種降解菲有一定的促進(jìn)作用；在萘的濃度為7.16mg/L時，菌種對菲的降解達(dá)到了最大值，去除率為43%。

（2）以萘為共代謝基質(zhì)在不同溫度條件下降解菲菌對同一濃度菲的降解。初始條件：菲的初始濃度為0.55mg/L，pH值為7，萘的初始濃度為7mg/L，菌懸液接種量為1%，轉(zhuǎn)速為150r/min。從以萘為共代謝基質(zhì)、在不同溫度條件下降解菲菌對同一濃度菲的降解曲線可看出，在30℃時菌種對菲的降解效果最差，對菲去除率為22%；而在35℃時，降解效果最好，對菲的去除率為42%。

3 菌種的生長曲線分析

準(zhǔn)備兩個錐形瓶，向錐形瓶內(nèi)分別接種1%的萘降解菌株和菲降解菌株，然后萘、菲混合后分別向兩個錐形瓶中投加足夠量以提供碳源，在30℃、150r/min搖床上培養(yǎng)，定時對菌株的生長進(jìn)行檢測，利用OD600來表征菌量的多少。

從萘、菲共同作為碳源降解萘菌、菲菌的生長曲線可以看出，兩株菌的生長均有明顯的對數(shù)增殖期（減速增殖期）、穩(wěn)定期、內(nèi)源呼吸期；另外，與單獨(dú)碳源相比，此時的細(xì)菌生長開始的適應(yīng)期較明顯，說明在萘、菲兩種碳源加入后，細(xì)菌對培養(yǎng)基的適應(yīng)需要一段時間；與菲菌的生長不同的是，萘菌生長的增殖期兩段比較明顯，前10天細(xì)菌生長速度比較快，后10天細(xì)菌也在生長，但生長速率比前10天略小；基本上在40天的時候，兩株菌的菌量都在減少，到60天時趨于穩(wěn)定。

4 結(jié)論

（1）以菲為共代謝基質(zhì)萘降解菌降解萘的最佳菲初始投加量為0.064mg/L，最佳溫度為35℃；以萘為共代謝基質(zhì)菲降解菌降解菲的最佳萘初始投加量為7.16mg/L，最佳降解溫度為25℃。

（2）在本實(shí)驗范圍內(nèi)以菲為共代謝基質(zhì)萘降解菌降解萘的最高去除率達(dá)到86%；以萘為共代謝基質(zhì)菲降解菌降解菲的最高去除率為42%。

（3）在萘、菲互相共代謝條件下兩種菌株的生長都有明顯的對數(shù)增殖期（減速增殖期）、穩(wěn)定期、內(nèi)源呼吸期，與單獨(dú)碳源條件下相比，此時細(xì)菌生長的適應(yīng)期明顯。

（欄目主持 楊軍）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.11.024

基金論文：重點(diǎn)防控重金屬汞、鉻、鉛、鎘、砷便攜/車載/在線監(jiān)測儀器開發(fā)與應(yīng)用示范（2012YQ060115）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金資助（2652013101，2652013086，2652013087）。