黃 芳，周 宏，于姍姍

薤白揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化及化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析

黃 芳，周 宏，于姍姍

（南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211171）

以中藥薤白為原料，對(duì)薤白進(jìn)行加溫浸泡、超聲預(yù)處理后，采用水蒸氣蒸餾法提取薤白中揮發(fā)油。以揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，并利用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：最佳工藝條件為浸泡溫度40 ℃、超聲預(yù)處理30 min、液固比4.40∶1（mL/g）、蒸餾時(shí)間2.2 h，此條件下薤白揮發(fā)油提取率達(dá)1.030%。經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜分析，共測(cè)出其中17 個(gè)組分。采用峰面積歸一化法測(cè)定各組分的相對(duì)含量，其中已鑒定出的14 種化合物組分占提取物的93.46%。

薤白；揮發(fā)油；響應(yīng)面法；氣相色譜-質(zhì)譜

薤白（Allium macrostemon Bunge）為百合科蔥屬多年生草本植物，是一種安全、無毒的食用野菜，其鱗莖上屜蒸至半熟后曬干或烘干入藥稱作薤白[1-3]。薤白耐旱、耐瘠、耐低溫、適應(yīng)性很強(qiáng)，廣布于全國各地，屬于可持續(xù)利用資源，是一種藥食兼用的粗放型經(jīng)濟(jì)作物?，F(xiàn)代研究證明，薤白含有多種生物活性成分，具有抗菌消炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、解痙平喘、防治動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[4]?，F(xiàn)已從薤白中分離得到揮發(fā)油、皂苷、含氮化合物、前列腺素等化學(xué)成分[5]。薤白揮發(fā)油的生物活性和藥理功效已有一些初步研究，其揮發(fā)油中許多成分都具有較高的藥用價(jià)值[6-7]，對(duì)薤白揮發(fā)油的主要生物活性成分進(jìn)行分離提取具有深遠(yuǎn)的理論價(jià)值和實(shí)際意義。

目前，揮發(fā)油的提取方法有水蒸氣蒸餾法[8-9]、有機(jī)溶劑提取法[10-11]、超臨界流體萃取法[12-13]、微波輔助提取法[14-15]及超聲波輔助提取法等[16-17]。雖然超臨界流體萃取法、微波輔助提取法等具有時(shí)間短和收效高等優(yōu)點(diǎn)，但其生產(chǎn)成本較高，難以在生產(chǎn)中普及。有機(jī)溶劑提取法容易引入雜質(zhì)，造成有機(jī)溶劑殘留[18-19]。水蒸氣蒸餾法工藝簡(jiǎn)單、便于操作，是《中國藥典》中揮發(fā)油含量測(cè)定所選用的方法[20]，林琳等[21]采用水蒸氣蒸餾和超臨界CO2萃取2 種方法提取薤白揮發(fā)油。但目前采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化薤白揮發(fā)油的水蒸氣提取工藝還未曾見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以薤白為研究對(duì)象，在提取前采用加溫浸泡、超聲預(yù)處理，通過單因素試驗(yàn)首先確定了浸泡溫度、超聲預(yù)處理時(shí)間、液固比等參數(shù)對(duì)薤白揮發(fā)油提取率的影響，然后采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法確定了水蒸氣蒸餾法提取薤白揮發(fā)油的最佳工藝條件，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技術(shù)對(duì)薤白揮發(fā)油中化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，為進(jìn)一步薤白揮發(fā)油的綜合利用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薤白購于南京中藥材市場(chǎng)，烘干粉碎，過40目篩備用。

無水硫酸鈉、環(huán)己烷（均為分析純） 南京化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

揮發(fā)油提取器 南京晚晴玻璃儀器廠；AUY120電子分析天平、UV2450紫外分光光度計(jì)、QP2010氣相色譜-質(zhì)譜儀 日本島津公司；HH-6水浴鍋 金壇市精達(dá)儀器制造廠；KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HDM型電熱套 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HK-068小型高速粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

稱取50 g粉碎后的薤白粉末裝入500 mL圓底燒瓶中，按照液固比4.40∶1（mL/g）加入蒸餾水，置于水浴中加溫浸泡1 h后，放入超聲清洗器中超聲30 min。將圓底燒瓶連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使之充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加入2 mL正己烷。將燒瓶置于電熱套上緩緩加熱至騰，并保持微沸一定時(shí)間。提取完成后，停止加熱，放置片刻。打開揮發(fā)油提取器下端活塞將水緩緩放出，收集環(huán)己烷層，50 ℃水浴揮去除正己烷，無水硫酸鈉干燥，得到薤白揮發(fā)油，精密稱質(zhì)量，按下式計(jì)算提取率：

1.3.2 揮發(fā)油提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以不同的浸泡溫度（20、30、40、50、60 ℃）、超聲預(yù)處理時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、液固比（3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1）（mL/g）及提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）為單因素，考察各因素對(duì)薤白揮發(fā)油提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化薤白揮發(fā)油提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)薤白揮發(fā)油提取率影響顯著的3 個(gè)因素，以薤白揮發(fā)油提取率為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和編碼Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3.4 色譜條件

色譜柱：HP-5MS石英彈性毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（99.999%）；流量1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度20 ℃，保持3 min，以6 ℃/min升至200 ℃，保持50 min；分流比1∶30；進(jìn)樣量1 μL；柱前壓49 kPa；氣化室及檢測(cè)器溫度均為250 ℃。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500；全離子掃描。

1.4 定性、定量分析

揮發(fā)油經(jīng)GC-MS檢測(cè)，所得質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜NIST 1.0譜庫檢索，并按各峰的質(zhì)譜裂片圖與文獻(xiàn)資料比對(duì)，確定薤白揮發(fā)油的主要化學(xué)成分；采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 薤白揮發(fā)油提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸泡溫度對(duì)薤白揮發(fā)油提取率的影響

圖1 浸泡溫度對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effect of soaking temperature on extraction yield of volatile oil

對(duì)薤白蒸餾提取前進(jìn)行加溫浸泡，是揮發(fā)油提取的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。由圖1可知，浸泡溫度對(duì)薤白揮發(fā)油提取率的影響較大。當(dāng)浸泡溫度較低時(shí)，揮發(fā)油提取率隨著浸泡溫度的升高而迅速增加。當(dāng)浸泡溫度為40 ℃時(shí)，薤白揮發(fā)油的提取率達(dá)到最高。此后再提高浸泡溫度，提取率反而迅速下降?？赡苁怯捎谒忸悡]發(fā)油的產(chǎn)生過程主要為酶促反應(yīng)，當(dāng)浸泡處于一定的適宜溫度時(shí)，酶的活力高，揮發(fā)油的轉(zhuǎn)化快，產(chǎn)率較高[22-23]。此后再增加溫度，酶因溫度過高而活力下降，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油提取率下降。故選擇適宜的浸泡溫度為40 ℃。

2.1.2 超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)薤白揮發(fā)油提取率的影響

圖2 超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic pretreatment time on extraction yield of volatile oil

本實(shí)驗(yàn)在蒸餾提取前增加了超聲波預(yù)處理，一方面超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)和空化效應(yīng)可有效地破碎藥材的細(xì)胞壁，使有效成分呈游離狀態(tài)并溶入提取劑中，另一方面超聲波的攪拌作用可加速提取劑的分子運(yùn)動(dòng)，使得提取劑和藥材中的有效成分快速接觸，從而加速有效成分的浸出速率[24-25]。由圖2可知，薤白揮發(fā)油提取率隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。當(dāng)超聲預(yù)處理時(shí)間達(dá)30 min時(shí)，揮發(fā)油提取率達(dá)到最大，此后再延長(zhǎng)超聲預(yù)處理時(shí)間，提取率增加不明顯，故選擇30 min為最佳超聲預(yù)處理時(shí)間。

2.1.3 液固比對(duì)薤白揮發(fā)油提取率的影響

圖3 液固比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction yield of volatile oil

從圖3可以看出，對(duì)一定質(zhì)量的薤白，隨著水量的增加，揮發(fā)油提取率呈現(xiàn)先上升后減小的趨勢(shì)。當(dāng)液固比達(dá)到4.5∶1（mL/g）時(shí)，溶劑對(duì)揮發(fā)油的提取達(dá)到飽和，揮發(fā)油提取率達(dá)到最大。此后，再繼續(xù)增加溶劑的量，揮發(fā)油提取率反而下降，故選擇液固比4.5∶1（mL/g）為宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)薤白揮發(fā)油提取率的影響

由圖4可知，揮發(fā)油提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間在2 h之內(nèi)時(shí)，揮發(fā)油提取率增加明顯，說明提取時(shí)間短、提取不充分；在2 h后再增加提取時(shí)間，揮發(fā)油量增加趨近平緩，說明薤白中揮發(fā)油已基本提取完。為縮短提取時(shí)間節(jié)約能源，故選定提取時(shí)間為2 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of volatile oil

2.2 優(yōu)化薤白揮發(fā)油提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)2.2.1 二次多項(xiàng)式回歸模型的建立

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Responses surface central composite design and experimental results

以薤白揮發(fā)油提取率為響應(yīng)值，根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，方差分析見表3。

通過分析可以得到提取條件與提取率之間的二次多項(xiàng)式模型為：

R=1.02+0.21A-0.017B-0.064C+0.021AB-0.047AC+0.043BC-0.27A2-0.092B2-0.26C2

浸泡溫度和提取時(shí)間的P＜0.0001，說明這2 個(gè)因素對(duì)揮發(fā)油提取率的影響極顯著。方差結(jié)果顯示，P＜0.0001，表明回歸模型極顯著。相關(guān)系數(shù)R2Adj為0.9947，說明建立的模型能夠解釋99.47%響應(yīng)值的變化來源于模型所選變量。方程失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合較好，實(shí)驗(yàn)誤差小。以上結(jié)果說明該模型能很好地描述薤白揮發(fā)油的提取過程中提取率隨提取條件的變化規(guī)律，能用于預(yù)測(cè)薤白揮發(fā)油提取過程中的提取率情況。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

2.2.2 各因素間的交互作用的分析

各因素間的交互作用及其對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過響應(yīng)曲面圖直觀反映出來（圖5）。當(dāng)浸泡溫度一定時(shí)，薤白揮發(fā)油提取率隨液固比和提取時(shí)間的增加先增加后降低；當(dāng)液固比一定時(shí)，揮發(fā)油提取率隨浸泡溫度和提取時(shí)間的增加先增加后降低；當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，揮發(fā)油提取率隨浸泡溫度和液固比的增加先增加后降低。圖5中各曲面較陡峭，說明3因素之間均有較強(qiáng)的交互作用。

2.2.3 模型的優(yōu)化和驗(yàn)證

通過分析可以得到最佳的薤白揮發(fā)油提取條件為：浸泡溫度39.14 ℃、液固比4.42∶1（mL/g）、提取時(shí)間2.2 h，提取率可達(dá)1.069%，根據(jù)實(shí)際情況，選擇浸泡溫度為40 ℃、液固比為4.40∶1（mL/g）、蒸餾時(shí)間2.2 h，測(cè)得薤白揮發(fā)油提取率為1.030%，與模型預(yù)測(cè)值接近，說明該模型可以很好的預(yù)測(cè)薤白揮發(fā)油的提取條件與薤白揮發(fā)油的提取率之間的關(guān)系，同時(shí)也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化薤白揮發(fā)油的提取工藝參數(shù)的可行性。

2.3 薤白揮發(fā)油的GC-MS分析

對(duì)上述優(yōu)化后得到的最佳工藝條件下得到的薤白揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果見圖6、表4。

從表4可以看出，薤白揮發(fā)油中共分離出17 個(gè)組分，鑒定了其中的14 種化學(xué)成分，占全部揮發(fā)油化學(xué)成分的93.46%。在已鑒定的揮發(fā)油化學(xué)成分中，含硫揮發(fā)性化合物13 種，占全部揮發(fā)油的88.39%。揮發(fā)油中的主要硫化物為二甲基三硫醚、甲基烯丙基三硫醚和二甲基四硫醚等，這些都是薤白揮發(fā)油的主要活性成分。其中，甲基烯丙基三硫醚的含量最高，占揮發(fā)油中總量的27.50%，已有研究表明該化合物對(duì)血小板聚集具有強(qiáng)烈抑制作用[3]。

圖5 浸泡溫度、液固比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)薤白揮發(fā)油提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of soaking temperature, liquid-to-solid ratio and distillation time on extraction yield of volatile oil

圖6 薤白揮發(fā)油總離子流色譜圖Fig.6 Total ion current chromatogram of volatile oil from Allium macrostemon Bunge

表4 薤白揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 4 Chemical components in volatile oil from Allium macrostemon Bunge

與文獻(xiàn)[3]相比，本研究所鑒定出的含硫化合物的組成存在差異，且各含硫化合物相對(duì)含量不同，這可能與薤白的產(chǎn)地、氣候、生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)外，還與提取條件有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取薤白揮發(fā)油，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝。結(jié)果表明，該法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠。實(shí)驗(yàn)中回歸方程合理，能較好的預(yù)測(cè)各因素條件與提取率的關(guān)系。優(yōu)化得到的最適宜工藝參數(shù)為浸泡溫度40 ℃、超聲預(yù)處理30min、液固比4.40∶1（mL/g）、蒸餾時(shí)間2.2 h，在此條件下，薤白揮發(fā)油的提取率可達(dá)1.030%。采用GC-MS聯(lián)用法對(duì)揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了分離鑒定，從薤白揮發(fā)油中共分出17 個(gè)組分，鑒定了14 種化學(xué)成分，主要為含硫化合物，占全部揮發(fā)油化學(xué)成分的93.46%。

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Optimization of Extraction of Volatile Oil from Allium macrostemon Bunge and Chemical Composition Analysis by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

HUANG Fang, ZHOU Hong, YU Shan-shan
(School of Biochemical Engineering and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China)

The volatile oil from the bulbs of Allium macrostemon Bunge was extracted by steam distillation with soaking in hot water and ultrasonic pretreatment. Based on single factor experiments, the yield of volatile oil was selected as response value and the optimum extraction process was determined through response surface methodology. The chemical constituents of the volatile oil were analyzed by gas chromatography mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the optimal extraction conditions were soaking in 40 ℃ water with a liquid-to-solid ratio of 4.40:1 (mL/g), ultrasonic pretreatment for 30 min and distillation for 2.2 h. Under these conditions, the yield of volatile oil was 1.030%. Totally 17 compounds were detected and 14 of them were identi fi ed by GC-MS in the extracted volatile oil, together accounting for 93.46% of the total amount of extracted compounds based on peak area normalization.

Allium macrostemon Bunge; volatile oil; response surface methodology; gas chromatography-mass spectrometry

O657.63

A

1002-6630（2014）08-0080-05

10.7506/spkx1002-6630-201408015

2013-07-22

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21171097）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13KJD150001）；

南京曉莊學(xué)院科研項(xiàng)目（2012NXY18）

黃芳（1978—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)閺?fù)雜體系的分離與分析。E-mail：fanghuang1998@163.com