張 權(quán)，陳文生*，洪 亮，金春潔，褚洪潮

（貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州師范大學(xué)分析測(cè)試中心，貴州 貴陽(yáng) 550001）

有機(jī)氯農(nóng)藥作為一種持久性有機(jī)污染物（persistent organic pollutants，POPs），因具有高持久性、高生物累積性和生物毒性等特點(diǎn)越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1-3]。而在檢測(cè)不同介質(zhì)中低殘留量的POPs時(shí)，樣品的凈化過(guò)程就顯得尤為重要，只有對(duì)樣本進(jìn)行有效地凈化，以去除基質(zhì)干擾物，才能提高分析的靈敏度 以及定性、定量的準(zhǔn)確性。目前，分析基質(zhì)中有機(jī)氯農(nóng)藥時(shí)常用的凈化方法有：填充柱法、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法[4-5]、磺化法[6]、凝膠色譜（gel permeation chromatography，GPC）法[7-8]、基質(zhì)固相分散（mixture solid phase disperse，MSPD）法[9-10]等。而根據(jù)樣本基質(zhì)的復(fù)雜程度與待測(cè)物的特性而選擇合理的凈化方法是測(cè)定POPs的關(guān)鍵。

辣椒醬是一種使用比較廣泛的調(diào)味品，其原料（如辣椒、花生和五香料等）中可能帶入有機(jī)氯農(nóng)藥。同時(shí)，辣椒醬中還存在多種動(dòng)植物油脂和色素，基質(zhì)復(fù)雜，要檢測(cè)其中的農(nóng)藥殘留必須采用有效的提取、分離和凈化方式[11-12]。然而在對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的凈化方法中，將MSPD法與GPC聯(lián)合應(yīng)用于辣椒醬樣品中POPs的分析的文獻(xiàn)少見(jiàn)報(bào)道，而且對(duì)兩種凈化條件的優(yōu)化研究更少有報(bào)道。因此，本研究對(duì)樣品基質(zhì)首先經(jīng)MSPD除去大部分油脂和色素等大分子干擾基質(zhì)后，再通過(guò)GPC進(jìn)一步凈化，可以滿足辣椒醬及其制品中8 種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)中不同品牌的辣椒醬樣品均來(lái)自于貴陽(yáng)超市所售。

乙腈、正己烷、丙酮（均為色譜純） 天津科密歐有限公司；石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、二氯甲烷（均為分析純）、無(wú)水硫酸鈉（分析純，600%條件下灼燒4 h，貯于密封干燥器中備用） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；柱層析硅膠；Pesti Card石墨化碳黑填料（120～400 目）、C18填料（40～60 目） 美國(guó)Sepax-UCT公司；8 種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品、六六六（benzenehexachloride，BHC，包括α-BHC、β-BHC、γ-BHC和δ-BHC 4 種異構(gòu)體）、滴滴涕（dichlorodiphenyl dichloro-ethylene，DDT，包括p,p’-DDE、p,p’-DDD、p,p’-DDT和o,p’-DDT 4 種同系物） 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所（純度≥99.0%）。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀（配ECD檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；凝膠滲透色譜儀 德國(guó)LC-Tech公司；OSB-2000旋轉(zhuǎn)儀蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；DB-1701毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.32 μm） 貴州萊德色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；AB系列電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；80-2型離心機(jī) 上海醫(yī)療器械集團(tuán)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取8 種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品置于棕色容量瓶中，用高效液相色譜純正己烷定容至100.0 mL，將配制的質(zhì)量濃度為1.0 g/mL溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于－4 ℃冰箱保存。檢測(cè)前加入正己烷溶液梯度配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3.2 樣品制備

取適量辣椒醬樣品，經(jīng)粉碎、混勻后準(zhǔn)確稱取樣品2.0 g（精確到0.000 1 g）放入瑪瑙研缽中，加入2.5 g的C18填料（40～60 目）、0.5 g硫酸鎂及1.0 g氯化鈉混合后研磨3 min，加入適量的經(jīng)乙腈飽和的正己烷溶液攪拌至流體糊狀，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中超聲10 min，然后倒入裝有1.0 g石墨化碳黑粉末（120～400 目）和1.0 g無(wú)水硫酸鈉的填充柱中，壓實(shí)。用25.0 mL的經(jīng)乙腈飽和正己烷-乙酸乙酯（7∶3，V/V）分3 次洗滌研缽、缽錘及錐形瓶，洗滌液再淋洗層析柱，收集洗脫液于梨形瓶中于40 ℃水浴旋蒸至近干，加入10 mL正己烷-乙酸乙酯（7∶3，V/V）轉(zhuǎn)移至凝膠色譜柱上待凈化，將12～25 min洗脫液作為分析樣品凈化最佳時(shí)間段，設(shè)置流出洗脫液濃縮為1 mL，通過(guò)0.22 μm的有機(jī)系濾膜后采用GC-電子捕獲檢測(cè)器（electron capture detection，ECD）法分析。

1.3.3 色譜條件

凝膠滲透色譜條件：凝膠色譜柱（400 mm×25 mm）；Bio-Beads S-X3作為柱填料；流動(dòng)相為正己烷-乙酸乙酯（7∶3，V/V）；流速：5 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5.0 mL。

氣相色譜條件：D B-1 7 0 1毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.32 μm）；載氣及流速：氮?dú)猓ǎ?9.999%），1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1.0 μL；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；色譜柱升溫程序：初始溫度220 ℃，以8 ℃/min升至270 ℃，保持7 min至樣品全部流出。

2 結(jié)果與分析

2.1 稱樣量的選擇

分別稱取1.00、2.00、5.00 g辣椒醬樣品做空白實(shí)驗(yàn)。當(dāng)稱樣量為5.00 g時(shí)，由于辣椒醬基質(zhì)復(fù)雜造成色譜圖的雜質(zhì)峰產(chǎn)生干擾；稱取1.00 g時(shí)，由于稀釋倍數(shù)過(guò)大，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中的定量限。綜合考慮其凈化效果、雜質(zhì)干擾情況以及滿足定量限要求等因素，故實(shí)驗(yàn)選擇稱取2.00 g辣椒醬樣品。

2.2 提取劑的選擇

由于辣椒醬中存在的大量的色素、油脂是造成基質(zhì)干擾的主要原因，應(yīng)避免在提取過(guò)程中與農(nóng)藥共提取。通過(guò)研究表明，用乙腈飽和的正己烷溶液作為提取劑時(shí)，對(duì)辣椒醬基質(zhì)中色素、油脂的溶解能力較弱，對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥的溶解度較高，還可使正己烷極性增強(qiáng)，提取效果較好，從加入辣椒醬中的8 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的平均回收率結(jié)果來(lái)看可以滿足分析要求，所以實(shí)驗(yàn)中以乙腈飽和的正己烷溶液作為提取劑。

2.3 超聲提取時(shí)間的選擇

實(shí)驗(yàn)以乙腈飽和過(guò)的正己烷作為提取液，比較渦旋振蕩和超聲提取兩種方式對(duì)提取效果的影響，結(jié)果表明，兩者無(wú)顯著差異。另外，實(shí)驗(yàn)中改變超聲時(shí)間，分別為0、5、10、15、20 min時(shí)研究超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明：在保證提取效率的情況下，選擇超聲時(shí)間為10 min比較適宜。

2.4 凈化方式的選擇

2.4.1 MSPD凈化

在檢測(cè)有機(jī)氯農(nóng)藥殘留時(shí)，通常采用MSPD凈化或SPE凈化提取液，如石墨化碳柱、弗羅里硅土柱和中性氧化鋁柱[13-16]。本研究利用MSPD法對(duì)樣品進(jìn)行第一步凈化，分別比較MSPD法與直接過(guò)石墨化碳柱、弗羅里硅土柱和中性氧化鋁柱及使用不同淋洗劑后的凈化效果，最終對(duì)辣椒中加入8 種農(nóng)藥后的平均回收率如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)中利用C18填料去除辣椒醬樣品中的油脂和其他非極性干擾物，用石墨化碳黑粉末對(duì)辣椒醬樣品中的色素進(jìn)行凈化，通過(guò)大量?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了兩種物質(zhì)最佳的填料量，既避免用量過(guò)多造成浪費(fèi)又避免用量過(guò)少導(dǎo)致凈化效果不明顯的兩種現(xiàn)象，經(jīng)基質(zhì)固相分散萃取的樣品油脂含量明顯減少，提取液相對(duì)干凈，但仍有少量的油滴殘留在梨形瓶中，而且對(duì)滴滴滴、滴滴涕兩種農(nóng)藥造成一定干擾，故需GPC進(jìn)一步凈化。

2.4.2 GPC凈化

凝膠滲透色譜法能有效去除樣品中的脂類、色素等大分子干擾物，常用于復(fù)雜基質(zhì)食品中農(nóng)藥提取液的凈化[17-19]。因此，本研究在1.3.3節(jié)色譜條件下采用GPC進(jìn)行樣品第二步凈化，考察加入8 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的凈化效果，所得淋洗曲線如圖2所示。

圖 2 凝膠滲透色譜（GPC）淋洗曲線Fig.2 Elution curve of gel pemeation chromatography (GPC)

提取液經(jīng)GPC凈化后收集12～25 min的流出液即可進(jìn)行8 種農(nóng)藥殘留分析。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Bio-Beads S-X3作為柱填料，與8 種有機(jī)氯類農(nóng)藥分離效果較好，MSPDGPC凈化使之最大限度地降低了樣品復(fù)雜基質(zhì)帶來(lái)的背景干擾，從回收率來(lái)看可以滿足分析要求。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及空白辣椒醬樣品色譜圖如圖3所示。

圖 3 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（A）和空白辣椒醬樣品（B）色譜圖Fig.3 Chromatogram of pesticide standards and bank chili sauce sample

2.5 線性范圍和檢出限

在選定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度作校正曲線，獲得了8 種農(nóng)藥的線性范圍，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限，由表1可知，8 種農(nóng)藥線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)高，檢出限較低，本方法能夠滿足復(fù)雜基質(zhì)辣椒醬中農(nóng)藥多殘留分析的要求。

注：Y為峰面積；x為溶液質(zhì)量濃度。

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

在不含農(nóng)藥的樣品中分別添加低、中、高3 個(gè)水平的8 種有機(jī)氯農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行檢測(cè)5 次，8種農(nóng)藥的平均回收率為74.58%～102.86%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～5.45%，具體結(jié)果如表2所示。

表 2 8種農(nóng)藥在辣椒醬中的添加回收率和精密度（n=5）=5 Table 2 Recoveries and precision of 8 pesticides in spiked chili sauce (Table 2 Recoveries and precision of 8 pesticides in spiked chili sauce (n n = 5)= 5)農(nóng)藥 10 μg/kg 20 μg/kg 40 μg/kg回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%α-六六六 90.26 1.93 95.89 1.85 89.74 2.38 γ-六六六 88.92 3.43 93.24 2.83 97.55 3.61 β-六六六 101.15 4.78 99.48 4.13 93.19 5.22 δ-六六六 93.65 1.07 98.22 1.93 102.86 2.98 p,p?-滴滴伊 84.90 3.49 95.78 2.90 90.32 3.21 o,p?-滴滴涕 89.02 5.45 92.34 4.98 96.88 5.19 p,p?-滴滴滴 74.58 2.58 82.61 3.21 85.49 2.09 p,p?-滴滴涕 76.23 3.13 80.83 2.54 79.75 3.22

2.7 實(shí)際樣品分析

隨機(jī)抽取市售的6 種不同品牌辣椒醬樣品進(jìn)行檢測(cè)，在3 種樣品中發(fā)現(xiàn)有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留，檢出量均小于我國(guó)的辣椒中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)0.05 mg/kg[20]。

注：ND.未檢測(cè)到。

3 結(jié) 論

建立了MSPD-GPC凈化，氣相色譜法檢測(cè)辣椒醬中8 種有機(jī)氯類農(nóng)藥多殘留分析方法。本方法通過(guò)參照有關(guān)文獻(xiàn)，在SPE法、GPC法和MSPD凈化方式的選擇上進(jìn)行了一些改進(jìn)，解決了辣椒醬樣品前處理復(fù)雜、基質(zhì)干擾嚴(yán)重等難題，探索了一套新穎的樣品前處理方法，以GC-ECD進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品定性，外標(biāo)法定量，通過(guò)大量辣椒醬樣品實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，8 種有機(jī)氯類農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，回收率在74.58%～102.86%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～5.45%（n=5），檢出限為0.40～1.20 μg/kg，此方法可適用于辣椒醬及其制品中有機(jī)氯類農(nóng)藥多殘留分析。

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