徐 洋，余旭平，沈錦玉，姚嘉赟，郝貴杰，潘曉藝，尹文林

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310020；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001）

羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌溶血素的產(chǎn)生條件及特性

徐 洋1，2，余旭平1*，沈錦玉2，姚嘉赟2，郝貴杰2，潘曉藝2，尹文林2

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310020；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001）

不同的培養(yǎng)條件影響羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌分離株L4產(chǎn)生β-溶血素的溶血價(jià)。最佳培養(yǎng)條件為將種子液按1∶20的比例接種于THB肉湯培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)120h。該溶血素對(duì)熱非常敏感，在-20℃保存較穩(wěn)定，在4，28，37℃保存均易失活。人O型血紅細(xì)胞對(duì)該溶血素最敏感，其次為小鼠和羅非魚(yú)的紅細(xì)胞，再次為黃顙魚(yú)、鯽魚(yú)、人的A、B、AB型血紅細(xì)胞，草魚(yú)紅細(xì)胞對(duì)其最不敏感。

羅非魚(yú)；無(wú)乳鏈球菌；溶血素；培養(yǎng)條件；特性

近幾年來(lái)，中國(guó)幾大羅非魚(yú)主養(yǎng)區(qū)相繼暴發(fā)羅非魚(yú)鏈球菌?。?-7］，該病的傳播途徑多，且傳染能力極強(qiáng)，對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害。作者從2009年海南某地患暴發(fā)性鏈球菌病的羅非魚(yú)體分離鑒定一株羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌分離株L4［8］，該菌在綿羊血平板上產(chǎn)生β溶血現(xiàn)象，因此認(rèn)定該菌能夠產(chǎn)生β-溶血素。本試驗(yàn)就羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌溶血素產(chǎn)生的相關(guān)條件及其特性開(kāi)展研究，旨在為今后開(kāi)展羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌致病機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌分離株L4系作者從2009年海南某地患暴發(fā)性鏈球菌病的羅非魚(yú)體分離獲得。

Todd-Hewitt肉湯培養(yǎng)基（THB）和萘啶酮酸購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；多粘菌素E購(gòu)自湖北建國(guó)醫(yī)藥有限公司；淀粉、葡萄糖、Tween-80、SDS購(gòu)自湖州華生化工物資有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、小牛血清、瓊脂購(gòu)自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶血素的產(chǎn)生條件試驗(yàn)

于THB瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌分離株L4，挑取單菌落接種于THB，28℃靜置培養(yǎng)12h制成種子液。

培養(yǎng)溫度試驗(yàn)。將上述種子液按1∶20的比例接種于THB中分別置于4，28，37，40℃靜置培養(yǎng)120h，取樣測(cè)溶血價(jià)。

培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)。將種子液按1∶20的比例分別接種到THB、含6%小牛血清的THB和含25mg·mL-1BSA、3%Tween-80的THB中，28℃靜置培養(yǎng)，分別于12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144h取樣測(cè)溶血價(jià)。

培養(yǎng)環(huán)境試驗(yàn)。將種子液按1∶20接種THB，在28℃情況下，分別置于轉(zhuǎn)速110r·min-1搖床和靜置在細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)120h，取樣測(cè)溶血價(jià)。

1.2.2 溶血價(jià)的測(cè)定

將所取樣品經(jīng)6000r·min-1離心15min，上清液用PBS倍比稀釋?zhuān)偌尤氲润w積1%的人O型血紅細(xì)胞懸液，37℃靜置1h，3000r·min-1離心10min，記錄溶血情況，同時(shí)用PBS和1%的SDS分別加入等體積的1%的人O型血細(xì)胞懸液作陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以50%紅細(xì)胞溶解的最高稀釋度為溶血價(jià)［9-10］。

1.2.3 溶血素的特性試驗(yàn)

溶血譜試驗(yàn)。選取羅非魚(yú)、黃顙魚(yú)、鯽魚(yú)、草魚(yú)、小鼠和人的紅細(xì)胞制備1%的血紅細(xì)胞懸液，進(jìn)行溶血價(jià)的測(cè)定。

活性保存試驗(yàn)。將種子液按最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，12000r·min-1離心5min，取上清液。將上清液分別保存于-20，4，28，37℃，分別于24，48，72h測(cè)定溶血價(jià)。

熱敏感試驗(yàn)。將種子液按最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，12000r·min-1離心5min，取上清液。將上清液分別在37℃孵育1h，在56℃孵育30min，在100℃孵育1min，測(cè)定溶血價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)產(chǎn)生溶血素的條件

2.1.1 溫度

圖1表明，溫度對(duì)溶血素的溶血價(jià)有較大影響，28℃時(shí)溶血價(jià)最高，達(dá)64。

圖1 溫度對(duì)溶血素產(chǎn)量的影響

2.1.2 培養(yǎng)基和時(shí)間

表1表明，不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)溶血素的溶血價(jià)有顯著影響，在24h內(nèi)3種培養(yǎng)基中均未測(cè)到溶血素，溶血素溶血價(jià)最高的是在THB中培養(yǎng)120h；在含6%小牛血清的THB中，溶血素從60h開(kāi)始出現(xiàn)溶血價(jià)為4，到132h到達(dá)頂峰溶血價(jià)為16；在含25mg·mL-1BSA和3%Tween-80的THB中，溶血素從48h開(kāi)始出現(xiàn)溶血價(jià)為4，到120h達(dá)到最高峰溶血價(jià)為32。

表1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)溶血素溶血價(jià)的影響

2.1.3 環(huán)境

置于28℃110r·min-1搖床培養(yǎng)48h，測(cè)得溶血價(jià)僅為16；而在28℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)靜置48h，測(cè)得溶血價(jià)為64。

2.2 溶血素的特性

2.2.1 溶血譜

溶血素能溶解多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，其中人O型血紅細(xì)胞對(duì)其最敏感，溶血價(jià)可達(dá)64；其次為小鼠和羅非魚(yú)的紅細(xì)胞，溶血價(jià)為32；再次為黃顙魚(yú)、鯽魚(yú)、人的A、B、AB型血紅細(xì)胞，溶血價(jià)為16；而草魚(yú)紅細(xì)胞對(duì)其最不敏感，溶血價(jià)僅為8。

2.2.2 保存活性

表2表明，溶血素在-20℃保存較穩(wěn)定，在4，28，37℃保存均易失活，24h內(nèi)丟失絕大部分活性，但隨后活性丟失速度顯著變慢。

2.2.3 熱敏感性

溶血素對(duì)熱非常敏感。37℃處理1h，溶血價(jià)從64下降至16；56℃處理30min，溶血價(jià)從64下降至4；100℃處理1min，溶血價(jià)從64下降至0。

表2 保存溫度和時(shí)間對(duì)溶血素活性的影響

3 小結(jié)和討論

羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病已成為困擾羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，如何有效地防治此病，成為亟待解決的問(wèn)題。開(kāi)展毒力因子研究，明確致病機(jī)理將有助于解決這一問(wèn)題。

目前對(duì)魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力因子的研究主要集中在莢膜多糖、CAMP因子等［11-15］，未見(jiàn)溶血素研究的相關(guān)報(bào)道。因此魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌是否存在該外毒素有待進(jìn)一步驗(yàn)證。作者的研究結(jié)果表明魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌能產(chǎn)生β-溶血素，同時(shí)作者就溶血素的最佳產(chǎn)生條件及特性開(kāi)展了相關(guān)研究，明確了該外毒素的最佳產(chǎn)生條件，為今后成功復(fù)制該毒素提供保障。

該溶血素的溶血譜檢測(cè)結(jié)果顯示，人O型血紅細(xì)胞對(duì)其最敏感，其次為小鼠和羅非魚(yú)的紅細(xì)胞，再次為黃顙魚(yú)、鯽魚(yú)、人的A、B、AB型血紅細(xì)胞，草魚(yú)紅細(xì)胞對(duì)其最不敏感。說(shuō)明人O型血紅細(xì)胞與人的A、B、AB型血紅細(xì)胞存在顯著的差異，敏感性相差4倍；且人O型血紅細(xì)胞的敏感性高于小鼠和羅非魚(yú)的紅細(xì)胞。通過(guò)人工感染試驗(yàn)已明確該分離株對(duì)小鼠和羅非魚(yú)均具有較強(qiáng)致病力［8］，該分離株可能為人畜共患病原［16-17］。至于人血紅細(xì)胞不同型之間的敏感性差異有待研究。

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（責(zé)任編輯：張才德）

S91文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0528-9017（2014）07-1096-03

文獻(xiàn)著錄格式：徐洋，余旭平，沈錦玉，等.羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌溶血素的產(chǎn)生條件及特性［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（7）：1096-1098.

2014-05-15

湖州市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2010GG02）

徐 洋（1985-），女，浙江永康人，助理研究員，從事魚(yú)類(lèi)病害防治工作。E-mail：fionxu@foxmail.com。

余旭平。E-mail：xpyu@zju.edu.cn。