楊會杰，閻 昊，佟繼銘，劉永平

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德 067000)

赤雹根總皂苷對AA大鼠脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6表達的影響*

楊會杰，閻 昊，佟繼銘，劉永平△

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德 067000)

目的:觀察赤雹根總皂苷(TSTDR)對佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠脾臟指數(shù)和脾臟腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)表達的影響。方法:雄性SD大鼠60只隨機分為正常對照組，模型組，TSTDR低(40mg/kg/d)、中(80mg/kg/d)、高(160mg/kg/d)劑量組和雷公藤多苷組(12mg/kg/d)。大鼠右后足跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.1ml建立AA大鼠模型，成模后各用藥組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物21d。計算大鼠的脾臟指數(shù)，免疫組織化學染色法檢測各組大鼠脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達。結(jié)果:TSTDR中、高劑量組大鼠的脾臟指數(shù)顯著低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。TSTDR各劑量組大鼠脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平明顯低于模型組(P＜0.01，P＜0.05);并且，TSTDR中劑量組、TSTDR高劑量組大鼠脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平明顯低于TSTDR低劑量組(P＜0.01，P＜0.05)。結(jié)論:抑制脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達可能是TSTDR治療AA的機制之一。

赤雹根總皂苷;佐劑性關(guān)節(jié)炎;TNF-α;IL-1β;IL-6

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性進行性對稱性關(guān)節(jié)炎為主的一種全身性自身免疫性疾病，可導致關(guān)節(jié)破壞、畸形和功能障礙。佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)是最常用于RA研究的動物模型，其組織病理變化和發(fā)病機制與人RA相似[1]。滿藥赤雹根是葫蘆科植物赤雹(TDB)的干燥根，味苦、性寒，滿族民間用于治療跌打損傷、肌肉痛、腰腿痛、風濕痛等，療效顯著，且無明顯毒副作用，具有重要的開發(fā)利用價值[2]。赤雹根總皂苷(TSTDR)是赤雹根主要的有效成分，前期研究顯示TSTDR可明顯降低AA模型大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，對RA治療效果顯著[3-5]。本研究進一步觀察了TSTDR對AA大鼠脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6表達的作用，以豐富TSTDR治療RA的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 弗氏完全佐劑(FCA)，美國Sigma公司，批號:100M8725;兔抗鼠TNF-α、IL-1β、IL-6一抗，美國Bioworld公司;免疫組化試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司;雷公藤多苷片(TG)，安徽新隴海藥業(yè)有限公司，批號:100301;TSTDR，承德醫(yī)學院中藥研究所藥理毒理研究室制備。

1.2 實驗動物分組與處理 8周齡雄性SD大鼠60只，體重180-200g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號:SCXK京2009-0007。大鼠隨機分為正常對照組，模型組，TSTDR低、中、高劑量組和TG組，每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠均于右后足跖部皮下注射FCA 0.1ml，以注射點周圍出現(xiàn)明顯白泡為佳，以致炎后第18d大鼠AI值≥6為成模標準[6]。成模后各用藥組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃給予等容積蒸餾水，各組大鼠連續(xù)給藥21d。

1.3 檢測脾臟指數(shù) 大鼠稱重后處死，取脾臟稱重，計算脾臟指數(shù)=[脾臟重量(mg)/大鼠體重(g)]×100[7]。

1.4 檢測脾臟TNF-α、IL-1β和IL-6的表達 采用SP免疫組織化學染色法，一抗稀釋濃度均為1:100，以PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復染。10×20倍光鏡下觀察各個因子的表達情況，以細胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃至褐黃色顆粒狀著色者為陽性細胞。采用IPP 6.0軟件測定脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6免疫組化染色的IOD值，取平均值進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脾臟指數(shù) 模型組大鼠的脾臟指數(shù)明顯高于正常對照組(P＜0.01);TSTDR中、高劑量組大鼠的脾臟指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.01，P＜0.05)。見附表。

附表 各組大鼠的脾臟指數(shù)和脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(±s，n=10)

附表 各組大鼠的脾臟指數(shù)和脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(±s，n=10)

與模型組比較:aP＜0.01，bP＜0.05;與TSTDR低劑量組比較:cP＜0.01，dP＜0.05

組別 劑量(mg/kg) 脾臟指數(shù)(g/100g) TNF-α(IOD值) IL-1β(IOD值) IL-6(IOD值)正常對照組 — 0.16±0.026a 0.09±0.02a 0.11±0.03a 0.17±0.05a模型組 — 0.21±0.041 1.52±0.28 1.61±0.34 1.48±0.31 TSTDR低劑量組 40 0.20±0.081 1.01±0.22b 0.98±0.29b 1.12±0.29 TSTDR中劑量組 80 0.18±0.015b 0.54±0.13ad 0.49±0.18ad 0.57±0.21bTSTDR高劑量組 160 0.16±0.021a 0.47±0.15ad 0.35±0.11ac 0.48±0.16adTG組 12 0.18±0.026 0.39±0.11ac 0.41±0.12ac 0.51±0.14ad

2.2 脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達 與正常對照組比較，模型組大鼠脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，TSTDR各劑量組大鼠脾TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);并且，TSTDR中劑量組、TSTDR高劑量組大鼠脾TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平明顯低于TSTDR低劑量組(P＜0.01，P＜0.05)。見附表。

3 討論

目前，類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病機制尚不清楚，近來的研究表明，細胞因子和各種炎癥細胞組成了RA發(fā)病的復雜免疫網(wǎng)絡(luò)，并且細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等在這一網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵性的作用[8]。

脾臟是最大的外周免疫器官，其相對重量的變化是反映機體免疫功能最基本和最常規(guī)的指標。脾中定居有各種炎癥細胞，并釋放細胞因子，其中IL-1β是重要的炎癥因子，主要由單核/巨噬細胞分泌，能激活破骨細胞，加重滑膜的炎癥反應(yīng)[9]。IL-1β是使RA炎癥反應(yīng)應(yīng)答放大并轉(zhuǎn)化為破壞反應(yīng)的重要細胞因子;TNF-α是強有力的促炎癥細胞因子，可介導IL-1β的生成，并且具有類似IL-1β的致炎作用;IL-6可介導產(chǎn)生TNF-α、IL-1β及促進類風濕因子的產(chǎn)生[10]。因此，可從抑制這三個炎癥因子的表達及阻斷它們的作用途徑探尋治療RA的新方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，TSTDR可明顯降低AA模型大鼠的脾臟指數(shù)和脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平，表明TSTDR可通過降低脾臟指數(shù)和炎癥因子的水平發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。其中高、中劑量TSTDR對脾臟IL-1β、TNF-α和IL-6表達的抑制作用更為突出，提示TSTDR可能具有直接抑制IL-1β和TNF-α表達的作用，也可能是因為TSTDR通過抑制IL-6的表達起作用，進而抑制RA病程的進展。本研究提示TSTDR可作為良好的抗RA藥物深入研究，從而為臨床治療RA提供新思路。

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EFFECTS OF TSTDR ON TNF-α, IL-1β AND IL-6 EXPRESSION IN SPLEEN OF AA RATS

YANG Hui-jie, YAN Hao, TONG Ji-ming, et al (Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To study the effects of total saponins of Thladiantha dubia root (TSTDR) on spleen index and TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen of adjuvant arthritis (AA) rats.Methods:60 male SD rats were randomly divided into the following 6 groups with 10 rats in each group: normal control group, model group, TSTDR low dose (40 mg/kg/d) group, TSTDR middle dose (80 mg/kg/d) group, TSTDR high dose (160mg/kg/d) group and tripterygium glycoside group (12mg/kg/ d). The AA rats’ model was established by injecting Freund’s complete adjuvant into the plantar subcutaneous layer of right rear foot of rats, and then the rats in each drug group were lavaged with corresponding drugs for 21 days. The spleen index of rats in each group was calculated and immunohistochemical method was used to detect the TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen.Results:The spleen index of rats in TSTDR middle and high dose group were obviously lower than that of rats in model group (P＜0.01, P＜0.05). The TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen of rats in each TSTDR group were all significantly lower than model group (P＜0.01, P＜0.05); Moreover, The TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen of rats in TSTDR middle and high dose group were significantly lower than TSTDR low dose group (P＜0.01, P＜0.05).Conclusions: Inhibition of TNF-α, IL-1β and IL-6 expression in spleen may be one of the mechanisms of TSTDR for treating AA.

Total saponins of Thladiantha dubia root (TSTDR); Adjuvant arthritis; TNF-α; IL-1β; IL-6

R963

A

1004-6879(2014)01-0008-03

2013-07-18)

* 河北省自然科學基金項目(C200800655)，河北省教育廳重大項目(ZD2010131)

△ 通訊作者