孫啟天，高 宇，劉曉燕，賀曉磊，邢恩鴻，孫立新

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000; 2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

高糖、高胰島素及二甲雙胍對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響*

孫啟天1，高 宇2△，劉曉燕2，賀曉磊2，邢恩鴻2，孫立新2

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000; 2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的:探討高糖、高胰島素和不同濃度二甲雙胍對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響。方法:體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，分別給予高糖和(或)高胰島素及不同濃度的二甲雙胍進行干預(yù)，MTT法檢測MCF-7細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果:高糖、高胰島素、高糖高胰島素作用不同時間均可促進MCF-7細(xì)胞增殖;不同濃度的二甲雙胍干預(yù)后，MCF-7細(xì)胞的生長均受到一定程度的抑制，且隨時間和濃度的增加而增加。結(jié)論:不同濃度二甲雙胍可對高糖、高胰島素作用下乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖起到抑制作用，且呈時間和濃度依賴性。

MCF-7細(xì)胞;葡萄糖;胰島素;二甲雙胍;細(xì)胞增殖

近年的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病可以導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并影響腫瘤患者的存活率。流行病學(xué)調(diào)查顯示，降糖藥物二甲雙胍可以降低糖尿病患者腫瘤的發(fā)生率[1]。女性45-49歲、60-64歲是乳腺癌的高發(fā)階段，患有糖尿病的女性更易患乳腺癌。并且，乳腺癌合并2型糖尿病是乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)后危險因素，但機制不明。本研究應(yīng)用高糖和高胰島素體外處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，模擬糖尿病患者的體內(nèi)環(huán)境，探討二甲雙胍對MCF-7細(xì)胞體外增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):使用含10%血清的低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，于37℃、5% CO2、飽和濕度無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組:細(xì)胞分為普通組、高糖組、高胰島素組、高糖高胰島素組。其中，普通組葡萄糖濃度為5mmol/ L、胰島素濃度為0mU/L，高糖組葡萄糖濃度為20mmol/ L、胰島素濃度為0mU/L，高胰島素組葡萄糖濃度為5mmol/L、胰島素濃度為125mU/L，高糖高胰島素組葡萄糖濃度為20mmol/L、胰島素濃度為125mU/L;以普通組作為普通對照組。另外，分別用濃度為0、2.5、5、10、20mmol/L的二甲雙胍干預(yù)各組細(xì)胞，其中，以二甲雙胍濃度為0mmol/L的干預(yù)組為干預(yù)對照組。

1.2.3 MTT法檢測MCF-7細(xì)胞的增殖情況:收集對數(shù)期MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔100μl接種于96孔板，每孔細(xì)胞密度為1500/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。5% CO2、37℃孵育至細(xì)胞貼壁，吸出培養(yǎng)液，按照上述分組分別加入葡萄糖、胰島素及不同濃度的二甲雙胍。孵育12h、24h、48h后每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，搖床上低速震蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長490nm處測量各孔的吸光值，實驗重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(干預(yù)對照組OD值-實驗組OD值)/干預(yù)對照組OD值×100%。細(xì)胞增殖率=實驗組OD值/普通對照組OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 作用不同時間MCF-7細(xì)胞的增殖情況 高糖作用24h、48h MCF-7細(xì)胞的增殖率雖然高于普通對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;高糖作用72h MCF-7細(xì)胞的增殖率明顯高于普通對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。高胰島素、高糖高胰島素作用24h、48h、72h MCF-7細(xì)胞的增殖率均明顯高于普通對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);但高糖、高胰島素作用同時間點，MCF-7細(xì)胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖作用同時間點比較，高胰島素、高糖高胰島素作用24h、48h、72h MCF-7細(xì)胞的增殖率均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 作用不同時間各組MCF-7細(xì)胞的增殖情況(%，±s)

表1 作用不同時間各組MCF-7細(xì)胞的增殖情況(%，±s)

與普通對照組相比:*P＜0.05;與高糖組同時間點比較:△P＜0.05

組別 2 4 h 4 8 h 7 2 h普通對照組 1 0 0 . 0 0 ± 1 9 . 6 3 1 0 0 . 0 0 ± 1 0 . 6 2 1 0 0 . 0 0 ± 2 0 . 0 8高糖組 1 0 6 . 9 2 ± 5 . 6 0 1 2 2 . 6 3 ± 1 7 . 5 8 3 1 3 9 . 7 8 ± 1 1 . 7 0*高胰島素組 1 3 0 . 0 4 ± 8 . 1 0△ 1 5 7 . 3 9 ± 4 . 6 7△ 1 7 4 . 1 8 ± 3 7 . 2△ 高糖高胰島素組 1 3 8 . 4 1 ± 1 2 . 7 0△ 1 5 7 . 7 1 ± 1 3 . 7 0△ 1 9 9 . 9 4 ± 2 7 . 3 1△

2.2 不同濃度二甲雙胍作用不同時間對MCF-7細(xì)胞的抑制作用 不同濃度二甲雙胍干預(yù)后，除干預(yù)對照組(0mmol/L)，其它二甲雙胍干預(yù)組MCF-7細(xì)胞的生長均受到一定程度的抑制，且隨時間及濃度的增加而增加，呈時間和濃度依賴性。見表2。

表2 不同濃度二甲雙胍作用不同時間MCF-7細(xì)胞增殖抑制率(%，±s)

表2 不同濃度二甲雙胍作用不同時間MCF-7細(xì)胞增殖抑制率(%，±s)

①不同濃度二甲雙胍作用相同時間比較:與干預(yù)對照組相比，aP＜0.05;與2.5mmol/L二甲雙胍組相比，bP＜0.05;與5mmol/L二甲雙胍組相比，cP＜0.05;與10mmol/L二甲雙胍組相比，dP＜0.05。②相同濃度二甲雙胍作用不同時間比較:與24h相比，eP＜0.05;與48h相比，fP＜0.05。

組別和作用時間 二甲雙胍( m m o l / L )干預(yù)對照組( 0 m m o l / L ) 2 . 5 5 1 0 2 0 2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 5 . 8 9 ± 0 . 9 1 1 2 . 4 7 ± 3 . 1 5ab 2 7 . 2 7 ± 1 1 . 9 7abc3 5 . 5 2 ± 2 . 8 5abcd普通組 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 6 . 0 9 ± 2 . 4 2a 1 3 . 9 ± 2 . 7 4a 3 2 . 0 7 ± 5 . 9 5abc4 3 . 9 7 ± 3 . 8 5abcd7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 7 . 0 5 ± 1 . 8 5a 1 7 . 6 6 ± 4 . 3 0abe 4 1 . 2 2 ± 8 . 4 6abce6 0 . 9 8 ± 5 . 1 2abcef2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 3 . 0 8 ± 0 . 6 2 9 . 8 7 ± 1 . 6 0ab 2 1 . 0 6 ± 5 . 0 5abc3 2 . 2 0 ± 1 . 9 1abcd高糖組 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 6 . 7 2 ± 4 . 1 4 1 3 . 9 9 ± 5 . 1 4ab 2 9 . 2 0 ± 5 . 6 2abce4 6．8 ± 5 . 5 8abcde7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 8 . 9 7 ± 2 . 9 0a 2 0 . 3 5 ± 5 . 6 8abeb 3 4 . 6 3 ± 3 . 4 3abcef5 3 . 0 8 ± 4 . 1 6abcd2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 3 . 7 5 ± 1 . 0 6 1 1 . 2 6 ± 2 . 4 0ab 2 6 . 7 8 ± 3 . 2 1abc3 7 . 7 8 ± 6 . 3 3abcd高胰島素組 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 4 . 9 3 ± 0 . 8 9 1 2 . 9 4 ± 2 . 3 0ab 2 7 . 2 6 ± 6 . 7 0abc4 5 . 3 4 ± 4 . 0 4abcde7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 5 . 7 4 ± 1 . 4 8a 1 7 . 8 3 ± 7 . 9 0ab 3 2 . 0 2 ± 5 . 2 0abc5 4 . 2 5 ± 6 . 6 3abcdef2 4 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 3 . 8 7 ± 0 . 4 5 1 1 . 2 0 ± 2 . 4 8ab 2 2 . 6 8 ± 3 . 4 7abc3 8 . 4 1 ± 2 . 2 3abcd高糖高胰島素組 4 8 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 4 . 1 8 ± 1 . 9 3 1 1 . 4 0 ± 1 . 4 4ab 3 0 . 9 5 ± 4 . 0 5abce4 7 . 9 5 ± 4 . 4 0abcde7 2 h 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 5 . 2 8 ± 1 . 8 8a 1 6 . 0 2 ± 5 . 3 6ab 3 4 . 4 5 ± 8 . 4 3abcef5 1 . 3 5 ± 8 . 1 1abcdef

3 討論

近年來多項研究已經(jīng)證實糖尿病患者腫瘤的發(fā)生率增高，高糖和高胰島素經(jīng)常同時出現(xiàn)于2型糖尿病患者，因此很難區(qū)分二者與腫瘤的具體關(guān)系。人們普遍認(rèn)為高血糖可使腫瘤的發(fā)生率增高，但最近的一項研究顯示，糖化血紅蛋白較低且嚴(yán)格控制血糖的患者與高糖化血紅蛋白的患者腫瘤發(fā)生率比較并無差異，因此認(rèn)為高血糖與腫瘤發(fā)生的關(guān)系并不密切[2]。此外，有一些研究發(fā)現(xiàn)胰島素與腫瘤的發(fā)生無關(guān)[3-4]。與此相反，有流行病學(xué)調(diào)查顯示，高胰島素水平的絕經(jīng)后非糖尿病女性患乳腺癌的風(fēng)險較高，提示高胰島素與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖作用72h才對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖率有所影響，而高胰島素和高糖+高胰島素作用24h MCF-7細(xì)胞的增殖率就明顯升高，說明胰島素對乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長的影響更為敏感。胰島素促腫瘤生長的可能機制包括激活胰島素受體及胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)，進而促進細(xì)胞的有絲分裂，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用;另外，胰島素還可降低IGF-1結(jié)合蛋白的水平，導(dǎo)致游離IGF-1的數(shù)量增加，使IGF-1和IGF-1R的結(jié)合增加，進而加強IGF-1的促腫瘤生長作用[6]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不同濃度二甲雙胍可對高糖、高胰島素作用下乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖起到抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。二甲雙胍是2型糖尿病的一線用藥，流行病學(xué)調(diào)查顯示，二甲雙胍可以降低糖尿病患者多種腫瘤的發(fā)病率，其抑制腫瘤可能包括多種機制，如抑制肝糖輸出、增強胰島素敏感性、降低循環(huán)中胰島素的水平等[7]。Libby等[8]認(rèn)為，二甲雙胍對腫瘤的抑制作用與用藥劑量相關(guān)，本研究也證實了這一點。

但本研究中使用的二甲雙胍濃度(2.5-20mmol/L)遠(yuǎn)高于二甲雙胍的臨床用藥濃度(10-40μmol/L)。有研究提示，濃度小于1mmol/L的二甲雙胍對腫瘤細(xì)胞的增殖并無抑制作用[9-10]。因此，對于臨床應(yīng)用二甲雙胍與腫瘤的關(guān)系，仍需進一步研究證明。

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EFFECTS OF HIGH GLUCOSE, HIGH INSULIN AND METFORMIN ON PROLIFERATION OF HUMAN BREAST CANCER CELL LINE MCF-7

SUN Qi-tian, GAO Yu, LIU Xiao-yan, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of high glucose, high insulin and different concentration metformin on proliferation of breast cancer cell line MCF-7.Methods:MTT method was used to detect the proliferation of MCF-7 cells after the MCF-7 cells were intervened by high glucose and/or high insulin and different concentration of metformin in vivo.Results:High glucose and/or high insulin could promote proliferation of MCF-7 cells at different action time. After intervened by different concentration of metformin, the growth of MCF-7 was inhibited to a certain extent which increased with time and concentration.Conclusions: Different concentration of metformin can inhibit proliferation of MCF-7 cells under the action of high glucose and high insulin, which shows time and the concentration dependence.

MCF-7 cells; Glucose; Insulin; Metformin; Cell proliferation

R737.9

A

1004-6879(2014)01-0001-03

2013-07-21)

* 承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(201121030)

△ 通訊作者