羅 飛，劉茵茵(綜述)，符曉華(審校)

(湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410013)

金雀異黃素是一種大豆體內天然存在的異黃酮類物質,有抗動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)和穩(wěn)定其斑塊的作用[1],但它生物利用度差，從而限制了它在治療心血管疾病和腦血管疾病中的應用。符曉華[2]以金雀異黃素為先導化合物，在其C-7位選擇性引入二氟亞甲基，同時5，4′位引入系列烷氧基，設計和合成了9個7-二氟亞甲基-5，4′-取代烷氧基異黃酮(7-difluoromethoxy-5,4′-dimethoxygenistein，DFMG)新化合物。以H2O21.0 mmol處理人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12細胞)24 h作為血管內皮氧化應激損傷模型，篩選對血管內皮氧化應激損傷具有保護作用的活性新化學實體。在篩選中發(fā)現(xiàn)DFMG抗血管內皮氧化應激損傷作用效價強度較其他新化合物強，且為先導物金雀異黃素的100倍?，F(xiàn)就DFMG對As作用機制的初步研究進行歸納。

1 DFMG的體內實驗研究

1.1DFMG抗As的作用機制 Zhao等[3]通過As兔模型研究發(fā)現(xiàn)，DFMG對As的作用主要有：減緩As的發(fā)展；降低血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白的水平；減少脂質的過氧化；增加平滑肌細胞和膠原的數(shù)量，穩(wěn)定As斑塊。游計良等[4]通過As兔模型研究發(fā)現(xiàn)，DFMG有較強的抗As的作用，其機制可能是：高水平的內皮素1(endothelin-1，ET-1)具有促進As形成的作用[5]，DFMG可顯著降低As血管中ET-1水平。其可能是通過抑制ET-1 mRNA表達來減少ET-1蛋白的分泌。一氧化氮生成減少可以導致血管張力異常,使血流剪切力改變,從而損傷內皮細胞，促使As發(fā)生[6]。DFMG能使血管內一氧化氮水平顯著升高，其機制可能是通過增強人血管內皮細胞一氧化氮合酶基因轉錄和蛋白合成,導致一氧化氮的產(chǎn)生增多。高同型半胱氨酸可促進As的形成[7]，DFMG能降低血管中的同型半胱氨酸。

1.2DFMG穩(wěn)定As斑塊的作用機制 As斑塊的穩(wěn)定性主要取決于斑塊的內部成分，而與斑塊的大小、多少、位置及管腔狹窄程度無關[8]。李程等[9]通過實驗發(fā)現(xiàn)，DFMG作用于家兔As模型可以穩(wěn)定其胸主動脈的As斑塊。其機制可能是通過影響As斑塊內的平滑肌細胞數(shù)量和膠原的含量而使粥樣斑塊的大小趨于穩(wěn)定。在對家兔As模型進行DFMG干預的實驗中，發(fā)現(xiàn)DFMG處理的As家兔模型的胸主動脈斑塊中膠原含量比模型對照組、金雀異黃素組和洛伐他汀組顯著增加[9]。其機制可能是DFMG通過抗血管內皮炎性反應機制，抑制血管內皮細胞表達金屬蛋白酶和干擾素γ的形成來抑制膠原分解促進膠原形成，從而穩(wěn)定As斑塊。Zhao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能增加平滑肌細胞和膠原的數(shù)量，穩(wěn)定As斑塊。由此可見，如何穩(wěn)定As斑塊，從而減少患者發(fā)生更為嚴重的斑塊破裂、動脈瘤、血管栓塞等在臨床上顯得更為重要。

2 DFMG的體外實驗研究

2.1DFMG對血管內皮細胞的保護作用 Fu等[10]研究表明，DFMG對血管內皮氧化應激損傷有保護作用。其特點主要有：①DFMG呈濃度依賴性的降低H2O2誘導血管內皮細胞乳酸脫氫酶的釋放。②DFMG呈濃度依賴性的提高H2O2孵育后的內皮細胞成活率。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能拮抗H2O2誘導內皮細胞凋亡。游計良等[12]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能改善乙酰膽堿誘導的血管內皮細胞依賴性舒張功能，對其進行保護。譚錦盛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG拮抗溶血性磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡且與其阻斷細胞活性氧類產(chǎn)生及由活性氧類激發(fā)的線粒體凋亡途徑有關。其機制主要有：DFMG可拮抗LPC上調細胞色素C、磷酸化c-Jun氨基端激酶、多腺苷二磷酸核糖聚合酶蛋白等與線粒體凋亡途徑密切相關的蛋白的表達，從而阻斷活性氧類促發(fā)的線粒體凋亡途徑。邢小偉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG拮抗LPC誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡且其機制與阻斷角蛋白18磷酸化表達有關。Liu等[15]研究表明，DFMG能有效地保護血管內皮細胞。其研究發(fā)現(xiàn)，DFMG拮抗溶血性LPC誘導的內皮細胞損傷作用大于三羥異黃酮和維生素E，并發(fā)現(xiàn)其機制可能與線粒體凋亡途徑有關，并且都有力地證實了DFMG對血管內皮細胞具有較好的保護作用。Chapman[16]提出血管內皮細胞受損和功能改變是As發(fā)生、發(fā)展的始動環(huán)節(jié)。Wei等[17]也提出內皮細胞損傷和凋亡是As發(fā)生早期的重要事件。那么，沒有內皮細胞損傷就難以形成As，也難以進一步發(fā)展惡化，因此DFMG可能有預防As的形成，阻止其進一步發(fā)展的作用。

2.2DFMG對血管內皮細胞E-選擇素、細胞間黏附分子1釋放的影響 王莉等[18]證明DFMG有抑制氧化應激損傷誘導的血管內皮細胞E-選擇素、細胞間黏附分子1釋放的作用，從而拮抗氧化誘導的內皮細胞與單核細胞黏附的作用。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，H2O2可誘導血管內皮細胞磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(diphosphorylated-extracellular signal-regulated kinase1/2，p-ERK1/2)表達上調,DFMG可下調內皮細胞p-ERK1/2的表達。DFMG可能通過抑制ERK1/2的磷酸化,進而抑制氧化誘導的內皮細胞與單核細胞的黏附。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，DFMG可以有效地抑制氧化應激和炎癥誘導的血管內皮細胞和單核細胞之間的黏合，其機制與核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的下調密切相關。Motawi等[19]研究表明，腦血管及心血管As患者中E-選擇素和細胞間黏附分子1的基因突變的頻率顯著高于對照組，其有促進As形成的趨勢，抑制E-選擇素、細胞間黏附分子1釋放有利于拮抗As的發(fā)生、發(fā)展。

2.3DFMG對血管內皮細胞白細胞介素6和腫瘤壞死因子α釋放的影響 研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能有效抑制氧化應激損傷血管內皮細胞炎性因子白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子α的釋放[9]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6通過有絲分裂原活化蛋白激酶和Jun激酶途徑下調As斑塊的穩(wěn)定性[20]。van der Valk等[21]也提出了拮抗IL-6產(chǎn)生等的As的新型抗炎戰(zhàn)略，其部分藥物已達臨床開發(fā)階段。腫瘤壞死因子α可通過介導內皮細胞損傷、破壞凝血-抗凝血平衡、促進黏附分子產(chǎn)生、促進基質金屬蛋白酶表達等促進As發(fā)生[22]。DFMG可能是一種以拮抗IL-6等因子產(chǎn)生的抗As新型活性化學實體。

2.4DFMG對血管內皮細胞NF-κB活性的影響 Madonna等[23]提出過量或不適當?shù)腘F-κB的激活可導致人發(fā)生炎性疾病，包括As等,而其作為一個潛在的治療As的新靶點已在臨床上的得到應用和重視。王莉等[18]在實驗中發(fā)現(xiàn)，H2O2可誘導血管內皮細胞NF-κB表達上調和活性增加，而DFMG可拮抗氧化應激損傷誘導血管內皮細胞NF-κB的表達上調和活性的增加以達到保護內皮細胞的目的。Fu等[10]發(fā)現(xiàn)，DFMG可以下調NF-κB的表達。

2.5DFMG與血管內皮細胞線粒體凋亡途徑 研究表明，胱天蛋白酶3(caspase-3)表達上調與As發(fā)生有關[24]。Park等[25]也有類似的研究，證明了內皮細胞死亡與caspase-3的活化密切相關。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DFMG能抑制H2O2誘導的內皮細胞caspase-3的上調。李程等[9]研究表明，DFMG可能通過降低H2O2處理的血管內皮細胞活性氧類的產(chǎn)生，阻斷死亡受體和線粒體凋亡信號轉導途徑下調的活性。

2.6DFMG對血管內皮細胞ERKl/2蛋白和角蛋白18磷酸化的影響 ERKI/2磷酸化增加內皮細胞與中性粒細胞的黏附，而ERK1/2磷酸化受到抑制時，氧化應激損傷得到一定程度逆轉[26]。 王莉[18]研究表明，DFMG可下調氧化應激損傷誘導的內皮細胞磷酸化ERKl/2的表達，說明DFMG能使內皮細胞的氧化應激損傷得到一定程度的逆轉。邢小偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，LPC可使人臍靜脈血管內皮細胞(HUVE-12細胞)Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18表達上調，而DFMG對此有拮抗作用。角蛋白18的活化可能通過調節(jié)Fas配體相關的死亡誘導信號復合物的形成，參與調節(jié)細胞凋亡[28]。

3 展 望

現(xiàn)有的對于DFMG抗As作用機制的初步研究大部分是圍繞其對內皮細胞的保護作用開展的。早在1993年Ross[29]就發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞異常增殖在As斑塊形成過程中發(fā)揮重要作用，近年來對于血管平滑肌的研究也是熱點。關于DFMG抗As機制中是否涉及抑制早期細胞增殖與遷移和保護斑塊內的平滑肌細胞是十分必要的。在DFMG的毒理學方面的研究較少，也是今后必不可少的研究課題。

前期研究已經(jīng)證實DFMG有較好的抗As的作用，其機制的初步研究中發(fā)現(xiàn)其作用途徑不完全與經(jīng)典抗As藥物相同，提示DFMG具有強大的潛力，很有可能成為新一代療效顯著的抗As的藥物。但其在臨床的應用還有很長的距離，尚需要進行更多的研究來推動DFMG的發(fā)展以及其他抗As藥物研究的發(fā)展。

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