霍桂桃,呂建軍,屈哲,林志,張頔,楊艷偉,李波

中國食品藥品檢定研究院,國家藥物安全評價監(jiān)測中心,北京 100176

果蠅(Drosophila melanogaster)是研究人類疾病發(fā)生機制的理想模式生物,果蠅和哺乳動物的許多基本生物學、生理學和神經系統(tǒng)機能等方面比較相似。果蠅作為研究人類疾病的模式生物,在神經退行性疾病發(fā)病機制研究中取得了很大進展,目前已經建立果蠅模型的人類神經系統(tǒng)退行性疾病包括：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷頓氏病(Huntingdon’s disease,HD)、朊蛋白疾病(Prion disease)等[1～4]。近年來,人們利用果蠅這一強大的遺傳學工具在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉移機制方面取得了很大的進展,而且,已經建立并完善了一套快速鑒定與腫瘤形成及發(fā)展相關基因的技術。果蠅和哺乳動物在基因和調控通路上的高度保守性、細胞過程的相似性以及腫瘤發(fā)生時腫瘤抑制因子出現證據上的保守性等使得果蠅在研究人類癌癥發(fā)生機制方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。本文就果蠅在腫瘤學研究中的優(yōu)勢、已經建立的研究人類癌癥的果蠅模型進行闡述,并對果蠅在腫瘤學研究中的應用前景進行了展望。

1 果蠅在腫瘤學研究中的優(yōu)勢

1.1 果蠅作為模式生物的優(yōu)勢

孟德爾關于豌豆的遺傳學研究是他在寺院進行研究的偶然結果,而與之相反,果蠅作為遺傳學研究的重要模式生物則是摩爾根尋找合適的物種進行遺傳學研究慎重考慮的結果。果蠅符合摩爾根提出的所有標準,即物種小、生活周期短、容易飼育并且可以獲得大量的后代[5]。果蠅的生活周期隨其生活的環(huán)境溫度不同而存在一定的變化,一般情況下,25℃飼養(yǎng)條件的生活周期為10天左右。一對生殖交配果蠅可產生幾百個遺傳學上一致的后代,而傳統(tǒng)的嚙齒類動物模型每3～4個月只能獲得極少數的后代[6]。

果蠅的發(fā)育經歷多個不同的階段,每個階段可作為不同研究目的的模型。果蠅的發(fā)育階段主要經歷胚胎期、幼蟲期、蛹期和成蠅期。胚胎通常用于基本發(fā)育研究,以檢測發(fā)育模式形成、細胞命運決定、器官發(fā)生、神經元發(fā)育以及神經軸突的正確形成。幼蟲,特別是能夠自由爬動的三齡幼蟲,經常被用于研究發(fā)育和生理過程,以及覓食行為。果蠅的幼蟲期對于藥物的研究特別有用,因為幼蟲連續(xù)進食,很少節(jié)制。果蠅幼蟲體內包含有其成年后的結構,如成蟲盤,成蟲盤主要由未分化的上皮細胞組成。從三齡幼蟲晚期到蛹期,這些結構經過形態(tài)學的變化,最后形成成年果蠅的結構。通過在蛹期對成蟲盤發(fā)育過程的分子及遺傳機制的研究,不僅為果蠅生物學提供了重要的理念,也為人類生物學研究提供了新的思路。因此,蛹是研究某些特定發(fā)育過程的理想模型。成蛹期結束后,新羽化的成年果蠅擁有許多進行遺傳學研究的評分結構,如剛毛、翅膀、復眼、觸角的類型等均可以在不致死的情況下發(fā)生突變,這就有利于分離到許多標志性的突變類型,是大多數遺傳學研究的重要工具。成年果蠅是一種相對高等的復雜生物,其體內有類似哺乳動物的心臟、肺、腎臟、胃腸和生殖道功能的結構。果蠅的大腦有 100 000多個神經元,形成具體的神經環(huán)路和神經纖維網,調控復雜的行為,如晝夜節(jié)律、睡眠、學習和記憶、求偶、覓食、打斗、梳理和飛行等[6,7～9]。

果蠅基因組全序列的測序和標注均已完成,果蠅共有4對染色體,編碼超過14 000個基因,其中3對染色體含有基因組中的大部分基因。以往的研究證明,果蠅體內的許多基因是人類致癌基因或腫瘤抑制基因的同源物。據統(tǒng)計,大約 75%與人類疾病相關的基因在果蠅體內可以找到同源基因[10],哺乳動物和果蠅的同源基因在核苷酸水平或蛋白序列上的整體同源性達到 40%,而在保守的功能區(qū)域,同源性可達到80%～90%[11]。

1.2 果蠅在腫瘤學研究中的優(yōu)勢

1.2.1 果蠅和人類在信號傳導通路上的保守性

眾多研究表明,果蠅和人類在信號傳導通路方面保守性極高,例如,Ras原癌基因的信號通路就是通過研究果蠅眼部感光細胞的發(fā)育而被首次闡明[12]。同時在原癌基因研究和果蠅遺傳學方面知識的積累為當代人類癌癥研究提供了重要的線索。例如,以果蠅 patched/hedgehog 信號通路上Patched突變引起痣樣基底細胞癌綜合征為線索,確定Patched為腫瘤抑制基因,為人類相應信號通路上的組件可能作為腫瘤抑制基因或致癌基因提供了線索。目前至少發(fā)現 patched/hedgehog信號通路上的 3個其他成員與哺乳動物腫瘤形成有關[13,14]。Notch基因最早在果蠅中發(fā)現,Notch基因缺失或突變可導致果蠅翅膀邊緣缺口,進一步的遺傳學和分子生物學研究表明許多Notch的調節(jié)器或靶點在進化上非常保守。果蠅 Notch信號的異常表達可導致過度增殖,人類NOTCH1基因的異常表達是引起T細胞急性淋巴細胞白血病的發(fā)病因素,同時 Notch信號的激活與許多造血系統(tǒng)腫瘤和固體腫瘤有關[15～17]。人類 JAK/STAT信號通路的紊亂可導致嚴重的疾病,包括癌癥、Polycytemia癥、嚴重的免疫缺陷、過敏以及神經缺失等; 果蠅 JAK/STAT信號通路調節(jié)造血干細胞的動態(tài)平衡,JAK激酶Hopscotch激活突變誘導可轉移的造血系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生,對照此結果的后續(xù)研究發(fā)現,人類造血干細胞JAK2激活突變與各種造血系統(tǒng)惡性腫瘤有關[18～20]。Wnt信號通路在進化中高度保守,在生長、發(fā)育、代謝和干細胞維持等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用; Wnt通路的過度激活與多種癌癥(包括結腸癌、胃癌、乳腺癌等)的發(fā)生密切相關。例如,在結腸癌患者中廣泛存在 Wnt通路的調節(jié)因子包括APC、beta-Catenin、Axin、TCF等基因的突變,從而造成與生長相關的基因過量表達[21～24]。對果蠅體內人類結腸腫瘤抑制因子APC基因同源物的研究表明,在某些特定的細胞類型中,APC是控制紡錘體定位的必要因素[25]。APC的亞細胞定位與Wnt信號在功能上不存在相關性,而APC氨基末端能夠促進 Wnt信號異常表達,這可能與截除氨基末端的APC變異體在人類大腸癌中選擇性保留有關[26]。另外,對果蠅發(fā)育的研究發(fā)現,在通過抑制氨基酸傳感和組成性激活 P13K信號的營養(yǎng)限制實驗中,中樞神經系統(tǒng)間變性淋巴激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)的含量要比其他組織中多,在人類 ALK的研究中發(fā)現,人類多種腫瘤中可檢測到ALK 的組成性激活[27,28]。Hippo信號通路通過協(xié)調細胞增殖和凋亡控制器官的尺寸大小,人類的許多癌癥過程中該信號通路出現下調。在果蠅體內的遺傳學篩選中發(fā)現wart、salvador、hippo和mob為腫瘤抑制基因,這些基因中任何一個功能喪失均可引起顯著的增生現象,主要是因為 cycE、DIAP1和bantam轉錄激活進而引起過度增殖和凋亡下降[29]。由此可見,果蠅和人類在多種信號通路上的保守性為深入研究腫瘤的發(fā)生機制提供可靠的信息。

1.2.2 果蠅的遺傳學可操作性

1.2.2.1 UAS-GAL4系統(tǒng) 果蠅作為模式生物的主要優(yōu)勢之一就是其基因的可操縱性,簡而言之,果蠅體內所有基因的活性,幾乎都可在任何細胞類型、細胞發(fā)育的任何階段增強或減弱[30]。目前的果蠅實驗技術為檢測致癌基因的發(fā)展背景提供了獨特的優(yōu)勢,例如,基因的異常表達效應就可很容易地利用果蠅來研究,這對研究腫瘤的形成原因非常有用,因為致癌基因通常會被異?；罨?如Ras基因)或過度表達(如細胞周期蛋白 D)[31]。果蠅研究者們在不用剖殺動物的情況下,通過特異的啟動子異位表達目的基因來研究該基因過度表達后的生物學特性。果蠅系統(tǒng)是獨一無二的,因為在果蠅體內可廣泛使用多種啟動子,包括全身性表達的啟動子(如熱休克蛋白或Actin啟動子)或組織特異性啟動子(神經元特異性或眼部特異性啟動子等),而且在某個時間范圍內,可以通過誘導一種熱休克蛋白啟動子在時間上控制基因的表達。組織特異性啟動子的多樣性可允許在不致死的情況下進行基因的特定組織的過表達研究。同樣,通過缺失或進行點突變,可將某個基因在體外進行修飾形成具有致癌性的突變基因,并在體內檢測致癌基因的活性,利用這種技術檢測表明,在2B型多發(fā)性內分泌腫瘤中,突變的Ret基因處于超活性狀態(tài)[32]。酵母UAS-GAL4系統(tǒng)的引入使得果蠅體內基因的異位表達研究變得更加容易,更加多樣化。在UAS-GAL4系統(tǒng)中,僅僅需要構建一個驅動目的基因表達的 UAS-cDNA質粒,攜帶UAS-cDNA質粒的果蠅品系可以和以組織特異性的模式進行表達 GAL4的果蠅品系雜交,通過雜交所獲取的后代則在特定的組織表達目的基因。這些先進的技術使得異位活化篩選技術得以發(fā)展,其中UAS原件隨機插入到果蠅的基因組中,然后便可對感興趣的過表達表型進行篩選。通過某些基因的過表達導致腫瘤形成來確定這種篩選可被用于確定果蠅致癌基因。同樣,UAS-GAL4系統(tǒng)也可在果蠅發(fā)育過程中異位表達哺乳動物致癌基因或抑癌基因,以評價這些基因的生物學功能[5,33]。

1.2.2.2 基于FLP/FRT的可抑制的細胞標記物的嵌合克隆(Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker,MARCM)系統(tǒng) 多個基因的變異累積往往會造成復雜的癌癥表型,而癌癥基因組圖譜計劃面臨的主要挑戰(zhàn)之一就是如何理解單個腫瘤中所匯聚的多個基因突變之間的相互作用,以及正常細胞向腫瘤細胞轉化所涉及的腫瘤微環(huán)境細胞與細胞之間的相互作用。因此,模擬癌癥發(fā)生發(fā)展的模型需能夠產生具有復雜表型的特定細胞數量和能在體內追蹤這些細胞的行為變化。果蠅作為研究癌癥發(fā)生機制的模擬系統(tǒng)可產生上述具有復雜表型的特定細胞(即克隆),其在組織內表現為表型正常的細胞,但包含多個突變。這種遺傳學上復雜的細胞克隆可通過MARCM系統(tǒng)產生,其原理是將FLP/FRT介導的突變體和非突變體之間的有絲分裂重組與 UAS-GAL4系統(tǒng)結合起來應用于基因的靶向表達或對特定組織內目的基因的RNAi[34]。Pagliarini、Leong、Martin-Belmonte、Igaki等[35～38]研究小組利用MARCM系統(tǒng)闡明了果蠅體內促進腫瘤生長的多基因元件和腫瘤轉移之間的合作作用,即通過對果蠅眼部成蟲盤scrib-突變克隆的研究發(fā)現,腫瘤發(fā)生的抑制是由癌組織周圍正常細胞激活的JNK調節(jié)的凋亡通路來實現的,而腫瘤發(fā)生和腫瘤轉移潛能的重新獲得則是通過同一克隆內 Ras信號上調的協(xié)同效應實現的。這些結果強調了scrib-克隆細胞周圍正常細胞的作用,這種細胞間的競爭效應類似于哺乳動物癌癥中所觀察到的; 如果同時激活Ras或Notch信號,JNK調節(jié)的細胞凋亡受阻,Ras/Notch則與JNK共同協(xié)作,促進腫瘤的生長和侵襲,即 JNK信號激活可促進Scrib缺陷細胞凋亡,當具有致癌活性的 Ras或Notch信號存在時,JNK則驅動細胞過度增殖和腫瘤發(fā)生; 同時也有研究證實細胞極性喪失和腫瘤發(fā)生在分子水平也存在一定的聯(lián)系,RasV12異常激活導致JNK活性及E-cad失活,從而使scrib-、dlg-及l(fā)gl-克隆細胞向周圍正常細胞轉移。以果蠅模型研究 JNK調節(jié)的腫瘤發(fā)生機制時,果蠅細胞所展現的多基因元素與 Ras信號協(xié)作促進腫瘤轉移的現象同樣也發(fā)生在哺乳動物乳腺上皮細胞中,這就提示以果蠅進行腫瘤學研究可有助于科學家們進一步闡明哺乳動物體內腫瘤形成及轉移機制。

1.2.2.3 雙股 RNA 干擾(dsRNAi)的基因篩選 果蠅的遺傳可操作性同樣也包括在特定的組織敲除目的基因以研究該基因的生物學功能或建立特定的疾病模型,通常使用 RNAi技術干擾特定基因的轉錄以降低基因的活性,從而達到靶向敲除目的基因的目的,即通過dsRNA反向重復表達引發(fā)由Dicer酶調節(jié)的復合物誘導同源序列靶向降解,這種基因敲除的方法在果蠅體內非常有效[39]。利用 dsRNAi進行基因功能的研究主要通過將dsRNA注入果蠅胚胎、體內組織特異性表達短的發(fā)卡結構的 RNA以及將dsRNA加入培養(yǎng)的細胞的方式來實現。世界轉基因果蠅庫所儲存的果蠅可條件性地表達干涉型雙股RNA,幾乎可以和果蠅基因組中 90%的基因發(fā)生靶向作用[40]。以果蠅為模型的基因組廣泛的 RNAi篩選主要集中于與醫(yī)學相關的幾個方面,包括衰老、肥胖、感染、神經系統(tǒng)疾病、癌癥等[41]。首次在果蠅體內發(fā)現的多個重要的基因,如原癌基因、腫瘤抑制基因、與細胞增殖、分化及死亡相關的重要基因就是通過 RNAi篩選獲得的[42]。利用果蠅實施基因組廣泛的 RNAi篩選的優(yōu)勢主要表現在以下幾個方面：dsRNAi篩選的有效性及良好的基因組注釋使得幾乎對任何基因及基因片段的研究成為可能; 果蠅和脊椎動物基因組的高度保守性以及重要信號通路的保守性為將果蠅模型的研究結果應用到脊椎動物提供生物學基礎; 果蠅強大的遺傳學工具和大量的化學、轉座子誘導的突變體果蠅及缺陷型果蠅品系為快速體內鑒定 RNAi篩選獲得的目標基因奠定了基礎; 此外,靶向基因敲除及具有發(fā)卡結構的RNA干涉方法的應用使得通過基因工程方法在特定基因中產生喪失功能的基因突變來分析基因的功能成為可能[33,43]。Willecke等[44]利用這一基因技術為篩選體內腫瘤生長所必需的基因建立了一個完善的系統(tǒng),這種建立在復雜遺傳背景基礎上的篩選方式可在果蠅體內進行系統(tǒng)的、全基因組廣泛性的篩選,加快研究者們對復雜疾病例如癌癥的理解。Neumüller等[45]利用 RNAi篩選發(fā)現有600多個基因參與調控果蠅成神經細胞的自我更新,其中有些基因為腦腫瘤抑制子,哺乳動物中這些基因的同源物行使腫瘤抑制子的功能,平衡自我更新及干細胞分化。Read等[46]以果蠅RNAi技術研究RTK和P13K信號依賴的腫瘤形成所必需新基因時發(fā)現,非典型蛋白激酶RIOK1和RIOK2以Akt依賴的方式在膠質母細胞瘤細胞中過表達,過表達的 RIOK2和 RIOK1、mTor以及 mTor復合物 2形成復合物,過表達的 RIOK2上調 Akt信號,促進小鼠星形膠質細胞腫瘤發(fā)生;相反,降低RIOK1或RIOK2的表達則使Akt信號中斷,通過 RpL11依賴的核糖體壓力檢驗點誘導 p53激活,從而導致膠質瘤細胞細胞周期結束、細胞凋亡以及化療敏感性增強。

1.2.3 果蠅相對缺乏基因冗余

脊椎動物基因組在進化過程中的復制常導致產生擁有多個同源旁系的基因子集,在后續(xù)的進化中出現基因子集擴展和蛋白功能的多樣性。由于這些基因擁有共同的祖先,通常這些基因編碼的同源蛋白保持功能上的重疊。當基于單個基因突變進行疾病模型的建立時,基因冗余可以遮蓋在模型動物中檢測表型的能力,因而使得以模型動物研究疾病發(fā)生機制變得更加復雜[33]。與人類等哺乳動物相比,果蠅基因組相對缺少基因冗余,例如Wnt 信號通路中的關鍵調節(jié)因子 TCF 在小鼠中擁有 4 種同源蛋白,而在果蠅中只存在一種同源蛋白[47],因此,利用果蠅作為替代模型研究Wnt信號通路中TCF的功能更容易獲得生理上相關的表型。

1.3 利用果蠅進行腫瘤學研究的局限性

果蠅并不是研究腫瘤發(fā)生所有方面的理想模型。例如,果蠅具有開放的循環(huán)系統(tǒng),不具有獲得性免疫功能。另外,果蠅的生命周期比較短,而人類癌癥從根本上講則主要和衰老有關。盡管人類的每個癌細胞發(fā)展所處的基因和微環(huán)境是決定腫瘤最終結果的關鍵因素,但是癌細胞發(fā)生、發(fā)展的復雜性卻很難用實驗動物模型來復制。雖然果蠅有一定的局限性,但利用果蠅模型進行癌癥方面的研究所取得的成果極大地促進了人們對癌癥的理解。

2 已經建立的研究人類癌癥的果蠅模型

2.1 人/果蠅嵌合體蛋白BCR-ABL轉基因果蠅

費城染色體上(Philadelphia chromosome,Ph)的BCR-ABL是第一個利用果蠅進行研究的人類致癌基因,幾乎所有的慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)和某些急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoid leukemia,ALL)都是由該基因引起[48]。人類9號染色體上的癌基因ABL鏈接到22號染色體上的斷點簇集區(qū)(BCR),形成p210BCR-ABL融合基因和p185BCR-ABL融合基因,這兩種融合基因使相應的BCR、ABL酪氨酸激酶持續(xù)激活,引起細胞增殖、黏附和生存性質的改變,從而導致 CML和ALL[49]。為了獲得BCR-ABL異構體的活動模式,Fogert等[28]構建了表達P210或P185人/果蠅嵌合體蛋白的轉基因果蠅,融合基因包括BCR、人ABLN端序列以及來自果蠅的存在較多差異的ABL的C端尾巴。P185和P210能夠挽救dAbl突變果蠅致死表型和ABL信號級聯(lián)的激活,而且它們的過表達還能產生獨特的優(yōu)勢表型,特別是眼睛。同時也能激活正常情況下ABL不能激活的信號通路。這種果蠅模型可進一步幫助研究者發(fā)現 BCR-ABL信號級聯(lián)的組成元件和與P210和P185相關的白血病的獨特臨床特征之間的差異[50,51]。

2.2 混合系白血病相關的染色體異位(Mixed lineage leukemia(MLL)-associated translocations)

MLL(Mixed-lineage leukemia) 基因,又稱HRX、HTRX1、ALL-1或TRX1基因,位于 11號染色體長臂2區(qū)3帶( 11q23) ,1991年由Ziemin-Van Der Poel等克隆[52]。MLL基因是造血過程調控的一個關鍵基因,其異常與白血病的發(fā)病密切相關。根據 Meyer等[53]所作的統(tǒng)計,MLL基因重排至少有104 種,而已鑒定出的MLL融合基因高達 64 種; 其中MLLAF9(與AML有關)和MLL-AF4(在ALL中發(fā)現)是頻繁易位的產物。盡管MLL和大多數MLL融合蛋白被整合到攜帶組蛋白修飾活性的大分子核復合物中,但是目前還不清楚 MLL融合蛋白是如何促進白血病發(fā)生的。在果蠅中表達MLL-AF4或MLL-AF9可誘導果蠅在蛹期致死,但這兩個融合蛋白對果蠅幼蟲大腦的增生和染色體濃縮有不同的作用,且在很大程度上顯示可不重疊結合到果蠅唾液腺染色體上[54]。這些現象表明二者具有不同的干擾通路。因此,MLL融合蛋白的C端伙伴基因(Partner gene)可能對嵌合體異?；顒泳哂懈匾淖饔?。

2.3 AML1-ETO融合基因和AML

果蠅是研究與人類致癌蛋白功能相關的增強子、抑制子及修飾基因的有價值的體內篩選平臺,在分析AML病人骨髓內的染色體異位時發(fā)現,一些轉錄因子在造血過程中起著非常重要的作用,且在白血病的發(fā)生過程中起到關鍵性的作用。這些因子包括AML1、LMO2、SALL以及SC1/Tali,所有這些因子都可以在果蠅體內找到同源類似物[55]。t(8;21)(q22; q22)染色體異位導致AML1-ETO融合蛋白產生,大概12%的AML病人屬于這種情況。AML1是一種具有RUNX結構域的蛋白,在造血過程的多個步驟中起到組織特異性轉錄激活子的作用; 而ETO(也稱作RUNX1T1和MTG8)則行使轉錄抑制子的功能。一般認為 AML1-ETO融合蛋白是 AML1蛋白功能的組成性抑制子,在抑制髓樣分化的同時促進多系祖細胞的增殖[56]。在果蠅中,RUNX因子Lozenge基因控制兩個主要的血細胞系中一個細胞系的出現和分化,而且,人類和果蠅的血細胞發(fā)育特點比較保守,由此表明果蠅可能是研究 AML1-ETO融合蛋白作用方式的模型[57,58]。AML1-ETO,特別是在 Lozenge血細胞系中,可誘導產生白血病早期表型,其特點是破壞細胞分化和血祖細胞數量增加。此外,AML1–ETO融合基因表達可導致果蠅在蛹期致死的表型。利用體內特異性的RNAi篩選策略,已經確定了Ca2+依賴蛋白酶CalpainB是AML1-ETO誘導果蠅所產生表型的主要因素。更重要的是,人鈣激活中性蛋白酶抑制可引起AML1-ETO降解,顯著地降低白血病細胞系t(8;21)+的克隆性生長,表明鈣激活中性蛋白酶抑制劑可能對白血病的治療有效。由此可見,果蠅是探尋AML1-ETO相關保守調節(jié)因子和研究治療AML化合物的有效模型[59,60]。

2.4 NF1基因和 1型神經纖維瘤(Neurofibromatosis 1)

1型神經纖維瘤是典型的兒童癌癥綜合征,是腦部及外周神經系統(tǒng)的一種良性腫瘤。雖然僅有一小部分神經纖維瘤患者會發(fā)生惡性轉移,但大部分患病兒童出現骨骼缺陷和記憶障礙,大多數患者的NF1基因發(fā)生突變[61]。果蠅體內實驗證明,NF1調節(jié)Ras信號通路。小鼠實驗證明,NF1活性降低,與p19ARF和p53共同促進疾病的進程[62]。這為開發(fā)治療神經纖維瘤的Ras通路抑制劑提供了理論基礎。

2.5 ErbB-2 基因和乳腺癌

ErbB-2與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關,是乳腺癌的一個重要分子標志物。ErbB家族信號通路是一個非常復雜的網絡系統(tǒng),其異常激活可引起細胞生長增殖失控、惡性轉化及腫瘤浸潤轉移。細胞培養(yǎng)實驗表明,存在于ErbB-2基因C末端尾巴的5個磷酸化酪氨酸(pTyr)中任何 4個發(fā)生自身磷酸化足以引發(fā)ErbB-2誘導的轉化[63]。以果蠅研究激活的ErbB-2(其C末端5個磷酸化酪氨酸均攜帶一個點突變)的結果顯示,激活的ErbB-2編碼的蛋白質所誘導產生的顯性表型類似于獲得等位基因功能果蠅EGFR的表型[64]。然而,這些表型可被不同的第二位點突變顯著抑制,這些突變能夠識別特定磷酸化酪氨酸下游的功能特異性配體(Adaptor)及第二信使。有研究表明,ErbB-2在結構上與果蠅EGFR的相關性比與其它哺乳動物EGFRs更強[65]。這就進一步強調了利用果蠅模型研究ErbB-2致癌基因活性的可靠性。

2.6 CDH1基因和遺傳性彌散型胃癌(Hereditary diffuse gastric cancer,HDGC)

遺傳性彌散型胃癌是常染色體顯性遺傳的遺傳性胃癌綜合征,占所有胃癌病例的 1%～3%,主要由胚胎時期編碼細胞黏附分子 E-cadherin(E-cad)的CDH1基因突變引起。研究者們在果蠅體內表達突變的E-cad來研究E-cad在HDGC中的作用[66]。在果蠅的翅膀上皮表達兩個錯義突變(A634V或V832M)的CDH1后,所表達的鈣粘蛋白仍保留鈣粘蛋白的一些功能,但在不同程度上干擾上皮細胞。事實上,盡管野生型和突變型CDH1定位正確,并與β-catenin 相互作用,但這兩種突變體可促進細胞向上皮細胞的基底側擠壓。另外,A634V細胞以細胞連接組的形式移動,V832M細胞則以小的細胞簇或隔離細胞的形式逃離上皮[67]。因此,以果蠅為模型的研究可以揭示由不同的CDH1錯義突變所導致的常見的和特定的功能改變。

2.7 腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)和腫瘤微環(huán)境

腫瘤細胞的微環(huán)境在調節(jié)腫瘤發(fā)生過程起到很重要的作用,癌癥相關的成纖維細胞以及周邊細胞與腫瘤細胞的類型有關。這些非轉化的細胞通過分泌生長促進信號、抗凋亡信號促進血管生成和組織入侵及轉移來調節(jié)腫瘤的發(fā)展進程。腫瘤細胞的主要特點是具有逃避程序性死亡的能力[68,69]。哺乳動物TNF可調節(jié)炎癥、免疫及細胞的構成,TNF一方面可促進正常細胞和發(fā)生惡性轉變細胞的程序性死亡,同時 TNF可促進炎癥發(fā)生和腫瘤轉移。果蠅TNF的同源物 Eiger(Egr)可促進或抑制腫瘤生成依賴于腫瘤的遺傳學背景。果蠅眼部和翅膀的 Scrib-/-細胞可通過細胞內小泡Egr-JNK調節(jié)的凋亡信號來清除,從scrib突變細胞(scrib-/-;egr-/-)中清除egr引起死亡抑制和促進腫瘤增生,提示egr在scrib突變體組織中具有類似腫瘤抑制子的功能,相反,去除不同遺傳背景細胞(scrib-/-;RasV12;egr-/-)中的egr可抑制侵入性腫瘤的發(fā)生,提示egr在Ras激活的背景下具有腫瘤增強子的功能; 去除循環(huán)血細胞中egr的功能同樣可以抑制腫瘤的發(fā)展,說明在促進 Ras腫瘤進程時,egr信號通路的作用是非自發(fā)的。因此,腫瘤微環(huán)境是免疫細胞富集的場所,通過 egr/TNF信號控制細胞的死亡或入侵以及調節(jié)腫瘤的發(fā)展進程[70～73]。

2.8 EGFR、P13K和腦膠質瘤

人類膠質瘤是來源于神經膠質及其前體細胞的一種致命性的侵襲性腫瘤。膠質瘤發(fā)生的同時EGFR和 P13K信號通路處于組成性激活狀態(tài)[74]。果蠅胚胎神經膠質細胞EGFR和 P13K信號通路的激活導致膠質細胞過度增殖以及幼蟲的大腦顯著增大。當把膠質瘤移植到果蠅腹部,則這種大腦來源的腫瘤不斷長大并入侵鄰近組織,而且導致與腫瘤發(fā)生相關的一系列基因網落激活,包括Myc、Rb、Cyclins和dTor[75]。有趣的是,EGFR/P13K信號通路在成神經細胞中的激活比較早,不會導致膠質細胞過度增殖,提示果蠅幼蟲膠質細胞可能存在一種不同于成神經細胞而有助于膠質細胞轉化的狀態(tài)。

Witter等[76]分析了在果蠅幼蟲眼盤膠質細胞中過表達激活的果蠅EGFR、P13K和其他酪氨酸激酶受體(PDGFR/VEGFR、InR、EGFR)的轉基因果蠅品系。這些轉基因促進膠質細胞增殖,而且,EGFR和P13K可誘導膠質細胞沿視神經異常遷移。因此,這些果蠅模型復制了人腦膠質瘤的主要組織學特征,包括沿神經束入侵大腦結構。過表達EGFR/P13K細胞的侵襲性可以通過飼喂果蠅幼蟲 EGFR抑制劑吉非替尼來部分逆轉,P13K的抑制劑渥曼青霉素或Akt的抑制劑曲西立濱可完全挽救過表達 EGFR/P13K細胞的表型。Read等[75]研究了激活果蠅幼蟲大腦膠質細胞D-EGFR或P13K信號后的表型。通過對這兩條通路不同組分的活性進行修飾后發(fā)現,EGFR和P13K通路誘導膠質細胞轉化起協(xié)同作用。移植以后,EGFR/P13K激活的膠質細胞產生較大的侵襲性腫瘤,刺激新的管道生長,其過程類似腫瘤血管生成。

2.9 PAX7-FKHR和橫紋肌肉瘤(Alveolar rhabdomyosarcoma,ARMS)

ARMS是一種侵襲性的兒童肌肉癌癥,是由兩種不同的染色體異位導致PAX3或PAX7的DNA結合域和FKHR/FOXO1的轉錄激活結構域之間產生嵌合體蛋白引起[77]。PAX-FKHR融合作為致癌基因,干擾骨骼肌肉分化。而正常情況下骨骼肌分化受PAX3和PAX7的調控。有趣的是,在ARMS小鼠模型中,PAX3-FKHR在分化的肌纖維中表達,而在肌肉干細胞中無表達,提示PAX3-FKHR惡性細胞可能在合胞體肌肉組織有絲分裂后產生[78,79]。然而,引起ARMS的細胞類型的起源仍然存在爭議。Galindo等[80,81]利用果蠅肌肉來評估PAX-FKHR的活性主要基于果蠅和脊椎動物生成肌肉過程的相似性和果蠅肌肉實時成像的可行性。值得注意的是,在分化的肌肉中表達PAX-FKHR引起合胞肌纖維的單個出芽并散播到其他組織。此外,分別增強或降低Ras的活性可增強或抑制PAX-FKHR相關的表型。因此,PAX-FKHR融合蛋白可能作用于Ras信號通路,通過“逆轉”或抑制肌細胞末端分化來促進腫瘤發(fā)生。更有意思的是,PAX-FKHR表達可誘導出現基因劑量敏感性的幼蟲致死性表型,這可以用于鑒定其功能性伙伴基因的遺傳性篩選工作。

2.10 Ret基因和多發(fā)性內分泌腺腫瘤綜合征 2型(Multiple endocrine neoplasia type 2,MEN2)

多發(fā)性內分泌腺瘤綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳性腫瘤,其發(fā)病與原癌基因Ret的突變與激活有關。目前已知MEN2型的突變位點位于Ret原癌基因第10號和11號外顯子編碼的半胱氨酸豐富的胞外區(qū)域。這些突變使胞外的一個保守的半胱氨酸突變?yōu)槠渌被?從而引起受體的二聚化,并引起其胞內部分酪氨酸殘基自身磷酸化,進而激活酪氨酸激酶途徑; 此外還有一些其他位點的突變在不引起受體二聚化的情況下,亦能引起受體自身磷酸化,進而激活酪氨酸激酶途徑[82]。果蠅和脊椎動物的Rets的表達模式相似,且果蠅體內的RetMEN2突變殘基保守[83]。在發(fā)育的果蠅眼部表達dRetMEN2A 或dRetMEN2B類似物的突變體可誘導產生一些與人類 MEN2腫瘤相關的表型缺陷,如促進細胞增殖、代償性細胞死亡和細胞分化異常[84]。這些眼部缺陷的程度與基因劑量有關。大規(guī)模的遺傳合作篩選準確定位了一定數量的RetMEN2的修飾位點。然而,所有這些修飾位點都可以和dRetMEN2A、dRetMEN2B發(fā)生相互作用,由此認為 MEN2A和MEN2B的表型區(qū)別可能是由于Ret激酶活性的改變不同,而并非是不同的信號特異性差異。人類同源基因的兩個修飾位點TNIK和CHD3/Mi-2a在MEN2相關的嗜鉻細胞瘤中出現雜合性丟失,由此推斷可能參與腎上腺組織腫瘤生成。此外,給果蠅幼蟲飼喂ZD6474(在細胞培養(yǎng)實驗中,可以阻止 RET來源的腫瘤蛋白的酪氨酸激酶的活性),可抑制dRetMEN2相關的表型[85]。因此,這種果蠅癌癥模型也可能被用來篩選治療用的化合物。

3 果蠅在腫瘤學研究中的應用前景

以果蠅為模型研究人類癌癥相關的致癌基因極其修飾組分的功能,可加速人們對腫瘤發(fā)生機制的理解,并為進一步發(fā)現用于腫瘤早期診斷的新的生物標志物、潛在的藥物作用靶點,為進一步研發(fā)抗癌藥物奠定基礎。雖然目前大多數研究仍集中在腫瘤抑制基因和腫瘤轉移機制方面,但現代果蠅研究的新技術和果蠅作為模式生物的獨特優(yōu)勢使得果蠅可能成為開發(fā)治療腫瘤藥物的理想系統(tǒng),用于抗癌藥物的低-高通量篩選和藥物作用靶點的發(fā)現。

利用果蠅進行腫瘤學方面的研究不免會遇到很多挑戰(zhàn),如致瘤性炎癥、體內篩選作用于癌癥干細胞的藥物、癌癥治療藥物的設計和發(fā)現等,這些挑戰(zhàn)將使研究者們以全新的角度認識和理解采用“多目標”的方法來治療癌癥。創(chuàng)新技術,如微陣列和納米技術、計算機和生物信息學與果蠅全基因組分析、染色質功能圖譜、果蠅基因組的順式調控圖譜等相結合,可以更準確地確定影響或決定單個癌細胞發(fā)展成腫瘤的基因網絡或通路。以上這些腫瘤學研究的新的方向,不僅強調了基礎研究的價值,也肯定了果蠅作為模式生物在研究癌癥復雜性方面的獨特優(yōu)勢。

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