杜挺挺，陳 蔭，鐘城城，王曉波，曲有樂(lè)

（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

貽貝多糖的結(jié)構(gòu)修飾及其體外抗腫瘤活性測(cè)定

杜挺挺，陳 蔭，鐘城城，王曉波，曲有樂(lè)

（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

采用三氧化硫吡啶法對(duì)厚殼貽貝多糖（MT1）結(jié)構(gòu)進(jìn)行硫酸化修飾，并對(duì)修飾后多糖進(jìn)行了體外抗腫瘤活性測(cè)定。在樣品：三氧化硫吡啶=1:6，溫度為90℃條件下反應(yīng)6 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：硫酸化多糖（MTS）得率為34%，且修飾后硫酸根含量從6.51%提升到32.95%。體外抗腫瘤活性測(cè)定結(jié)果顯示：濃度為8 mg/mL的MT1、MTS對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞作用72 h后的抑制率分別為79.35%、85.04%，且IC50為2.04 mg/mL，1.72 mg/mL；而對(duì)人肺癌H1299細(xì)胞作用72 h后的抑制率分別為:81.28%、85.32%，以及IC50分別為2.46 mg/mL，1.71 mg/mL。結(jié)論：在該條件下修飾后的硫酸化貽貝多糖能提高抗腫瘤活性。

貽貝多糖；硫酸化；抗腫瘤活性

厚殼貽貝為海洋軟體動(dòng)物門(mén)雙殼綱貝類，又稱海紅、淡菜，其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含活性物質(zhì)，在食用和藥用上都有很大價(jià)值，在舟山海域廣泛分布。研究表明貽貝多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血脂等多種功能活性[1-2]。貽貝多糖活性大小與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，文獻(xiàn)表明，一定含量范圍內(nèi)的硫酸根和磷酸根促使多糖具有更高抗腫瘤活性[3-5]。因此對(duì)其進(jìn)行硫酸酯化、磷酸化、烷基化等適當(dāng)?shù)男揎?，可獲得具有更高活性的多糖化合物[6-7]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)天然修飾的多糖的報(bào)道大多來(lái)自于菌類、植物中，而從海洋軟體動(dòng)物中，尤其是貝類中提取多糖進(jìn)行修飾的報(bào)道不多[8-10]。為此，本文從新鮮的厚殼貽貝中提取多糖，并進(jìn)行分離純化，再通過(guò)硫酸酯化修飾。分別從含量，取代度，結(jié)構(gòu)變化以及抗腫瘤活性等方面進(jìn)行初步研究，結(jié)果證明經(jīng)修飾后的厚殼貽貝多糖活性有所提高，為應(yīng)用于保健食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑

厚殼貽貝多糖（MT1）由本實(shí)驗(yàn)室制備；前列腺癌DU-145細(xì)胞和人肺癌H1299細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；三氧化硫吡啶、DMF、明膠為 Amresco產(chǎn)品；濃鹽酸為市售分析純?cè)噭?二甲基亞砜；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司。

1.2 儀器

HH-S型水浴鍋，鄭州科工貿(mào)有限公司；SL-12N型冷凍干燥機(jī)，南京順流儀器有限公司；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Necolit5D×B型紅外光譜儀，美國(guó)傅立葉變換紅外光譜儀；高速冷凍離心機(jī)，日立公司產(chǎn)品；Forma 3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 硫酸化修飾

1.3.1.1 硫酸化厚殼貽貝多糖的制備

采用了三氧化硫吡啶法[11-12]對(duì)厚殼貽貝多糖進(jìn)行了酯化，首先取50 mg厚殼貽貝多糖MT1,懸浮于3 mL DMF中攪拌30 min,然后加入0.3 g三氧化硫吡啶,在90℃下均勻攪拌,反應(yīng)6 h，然后加入3倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀,離心15 min(8 000 r/min)取沉淀,透析(3.5 kDa),冷凍干燥得硫酸化衍生物MTS。

1.3.1.2 硫酸基含量測(cè)定

貽貝多糖樣品中硫酸基含量的測(cè)定,采用氯化鋇-明膠比濁法。取樣品MT1和MTS各15 mg放入安瓿瓶中,分別加2 mol/L的三氟乙酸2 mL，封管，105℃下加熱6 h。吸取0.5 mL水解液在500 nm處測(cè)定其吸光度,以無(wú)水K2SO4作標(biāo)準(zhǔn)物獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算得硫酸基含量，取代度(DS)=1.62×S%/(32-1.02× S%)，S%是樣品中硫的百分含量。

1.3.2 紅外光譜測(cè)定

為進(jìn)一步鑒定厚殼貽貝多糖MT1經(jīng)硫酸化修飾后的結(jié)果，采用紅外光譜進(jìn)行鑒定。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定

采用MTT法[13]，將MT1、MTS分別配置成濃度為0.5 mg/mL，1.0 mg/mL，2 mg/mL，4.0 mg/mL，8.0 mg/mL五個(gè)濃度組，分別測(cè)定作用24 h、48 h和72 h后,對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞株和人肺癌H1299細(xì)胞株增殖的影響。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)修飾結(jié)果

由硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 硫酸根含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard carve of sulfate content

在本實(shí)驗(yàn)條件下，多糖硫酸化回收率為34%。數(shù)據(jù)顯示，多糖硫酸化產(chǎn)率偏低，其原因可能是高溫引起部分多糖被降解成低聚物，在后續(xù)處理過(guò)程中被透析。此外，高溫易引起多糖結(jié)構(gòu)破壞，因此更易產(chǎn)生副反應(yīng)而降低MTS產(chǎn)量[14]。經(jīng)氯化鋇-明膠法測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得MT1中硫酸根含量為6.51%，而MTS中硫酸根含量為32.95%，取代度從0.12提升到了0.86。硫酸根含量明顯增加。

2.2 紅外測(cè)定結(jié)果

硫酸化后的多糖除了在1 600 cm-1、1 400 cm-1、1 100 cm-1左右有特征吸收峰外，且在1 240 cm-1左右有明顯的吸收峰，說(shuō)明有S=O伸縮振動(dòng)，證明有硫酸基鍵存在；同時(shí)在850 cm-1附近也有吸收峰，說(shuō)明C-O-S的伸縮振動(dòng)，進(jìn)一步證明存在硫酸基鍵。紅外譜圖結(jié)果表明：貽貝多糖硫酸化修飾有成果。

2.3 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 MT1、MTS樣品對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞的抑制作用

本試驗(yàn)測(cè)定了MT1、MTS樣品對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞的增殖抑制作用,在用量和時(shí)間等因素考慮對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效率的影響。在一定范圍內(nèi)，隨著樣品濃度增加，對(duì)DU-145癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率越高；隨著作用時(shí)間增長(zhǎng)，癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也有所提高，呈現(xiàn)了時(shí)效和量效的關(guān)系，且硫酸化修飾后多糖抗腫瘤活性相對(duì)較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3～6所示。

圖2 MT1、MTS紅外譜圖Fig.2 IR spectrum of MT1,MTS

圖3 MT1、MTS分別添加24h后對(duì)DU-145抑制率Fig.3 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 24 h

圖4 MT1、MTS分別添加48h后對(duì)DU-145抑制率Fig.4 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 48 h

圖5 MT1、MTS分別添加72 h后對(duì)DU-145抑制率Fig.5 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 after 72 h

圖6 相同添加量MT1、MTS在不同時(shí)間對(duì)DU-145的抑制率Fig.6 Inhibitory effect of MT1,MTS on DU-145 in different time

2.3.2 MT1、MTS樣品對(duì)人肺癌H1299細(xì)胞的抑制作用

從圖7～10可以看出，在一定范圍內(nèi)，MT1和MTS對(duì)腫瘤細(xì)胞H1299的抑制作用隨樣品濃度的增加以及時(shí)間的增長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)了量效和時(shí)效的關(guān)系，且添加量的影響作用大于添加時(shí)間的影響。此外，圖中數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)硫酸化后的多糖MTS的對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于未修飾的多糖MT1。

圖7 MT1、MTS分別添加24 h后對(duì)H1299抑制率Fig.7 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 24 h

圖8 MT1、MTS分別添加48 h后對(duì)H1299抑制率Fig.8 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 48 h

圖9 MT1、MTS分別添加72 h后對(duì)H1299抑制率Fig.9 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 after 72 h

圖10 相同添加量MT1、MTS在不同時(shí)間對(duì)H1299的抑制率Fig.10 Inhibitory effect of MT1,MTS on H1299 in different time

3 結(jié)論

厚殼貽貝多糖的硫酸化與磷酸化同為聚陰離子修飾,國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究越來(lái)越重視。為了得到更多含硫的貽貝多糖化合物可以使活性增加的依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)化學(xué)合成的方法得到了厚殼貽貝多糖的衍生物，再通過(guò)分別測(cè)定未經(jīng)修飾的貽貝多糖MT1和經(jīng)化學(xué)修飾后的MTS的硫酸根含量，結(jié)果顯示經(jīng)修飾后貽貝多糖硫酸根的含量明顯提高。最后經(jīng)MTT法對(duì)MT1、MTS進(jìn)行初步抗腫瘤活性檢測(cè)，經(jīng)硫酸化修飾后的貽貝多糖對(duì)DU-145和H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制作用有所提高。在一定含量范圍內(nèi)硫酸基團(tuán)對(duì)多糖抗腫瘤活性起重要作用，為今后貽貝多糖硫酸化及衍生物在功能性食品或藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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Structure Modification and Research on Antitumor Activity of Mussel Polysaccharide

DU Ting-ting,CHENG Ying,ZHONG Cheng-cheng,et al
(Food and Pharmacy School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Mussel polysaccharide structure wasmodified bysulphur trioxide pyridine,and antitumor activity of Sulfated polysaccharides was investigated in vitro.The condition of Sulfuric acid esterification experiment was that:the quality proportion of sample and sulphur trioxide pyridine was 1:6,reaction temperature was 90℃and reaction time was 6h.It showed that:the yield of sulfated polysaccharide(MTS)was 34%,and the content of SO42-was improved from 6.51%to 32.95%.Antitumor activity test in vitro showed that:inhibitory effect of MT1, MTS on DU-145 was 79.35%,85.04%,and IC50was 2.04mg/mL，1.72mg/mL.The inhibitory effectno H1299 was 81.28%,85.32%and IC50was 2.46 mg/mL,1.71mg/mL.Conclusion:Sulfated polysaccharide can improve the antitumor activity.

mussel polysaccharide;sulfating;antitumor activity

S284

A

1008－830X(2014)04－0354－04

2014-03-20

浙江省科技廳項(xiàng)目（2010R50029-19）

杜挺挺（1991-），女，浙江東陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：天然藥物提取.E-mail:714716887@qq.com

曲有樂(lè)（1960-），男，教授，研究方向：天然藥物活性結(jié)構(gòu)改造與設(shè)計(jì).E-mail:youle1960@163.com