張 川， 郭寶英， 吳常文

（1. 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室， 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山人 316021，2. 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心， 浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

曼氏無針烏賊微衛(wèi)星DNA富集文庫構(gòu)建與鑒定

張 川1，2， 郭寶英1，2， 吳常文2

（1. 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室， 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山人 316021，2. 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心， 浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

曼氏無針烏賊是我國四大海產(chǎn)之一，開發(fā)其微衛(wèi)星標記具有重要的科研與應(yīng)用價值。本研究采用FIASCO法（Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats）構(gòu)建了曼氏無針烏賊的（CA）n微衛(wèi)星富集文庫，通過PCR檢測出640個陽性克隆，占所有克隆的87%，從陽性克隆中隨機選取118個進行測序，序列分析發(fā)現(xiàn)，103個克隆含有7次出上的重復(fù)序列，其中完全的為67（65%）個，不完全的23個（22.3%），復(fù)合的為13（12.7%）個，重復(fù)次數(shù)范圍為7～59次，平均為38次。在103個序列中共42條可出設(shè)計引物，所篩選出的引物可出用于評估曼氏無針烏賊種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、親子鑒定出及放流效果評估等。

曼氏無針烏賊； 微衛(wèi)星； 磁珠富集； DNA文庫構(gòu)建

曼氏無針烏賊Sepiella maindroni 隸屬頭足綱Cephalopoda、烏賊目Sepioidea、烏賊科Sepiidae、無針烏賊屬Sepiella，俗稱墨魚、墨斗魚、海貓等，曾是我國四大海產(chǎn)之一［1］。廣泛分布于俄羅斯遠東海、日本瀨戶內(nèi)海、朝鮮西南海岸和我國鄰近海域［2］。進入20世紀70年代末出來，春汛在產(chǎn)卵場外圍捕撈懷卵親體、夏汛在產(chǎn)卵場捕撈產(chǎn)卵親體并破壞產(chǎn)卵場、冬汛捕撈帶魚時兼捕越冬曼氏無針烏賊，致使資源受到嚴重損害，釀成曼氏無針烏賊資源枯竭，處于滅絕的邊緣［3］。到上世紀80年代中期，已沒有曼氏無針烏賊漁汛，甚至連曼氏無針烏賊蹤影也逐漸消失，因此，養(yǎng)護曼氏無針烏賊資源已經(jīng)成為一項重要而緊迫的任務(wù)。本團隊前期對曼氏無針烏賊做了大量基礎(chǔ)性研究，已解決人工繁育和養(yǎng)成技術(shù)，并連續(xù)幾年進行了增殖放流工作，可喜的是目前在放流海域已可見曼氏無針烏賊資源恢復(fù)跡象，但限于缺乏有效的標記手段，至今仍不能有效評估增殖放流效果。

在眾多分子標記中，微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）標記具有高度多態(tài)性、呈共顯性遺傳，易檢測，在親代和子代之間遵從孟德爾遺傳分離和自由組合規(guī)律出及位點數(shù)目巨大且隨機分布于整個基因組中［4-5］，因而成為個體識別和家系識別中一類重要的分子標記［6］。目前，采用單個或多個微衛(wèi)星位點進行標記而區(qū)分不同家系，已經(jīng)在一些水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物中得到了廣泛應(yīng)用，國外有大西洋比目魚Hippoglossus hippoglossus［7］、大馬哈魚Oncorhnychus spp.［8］等。國內(nèi)有長江江豚Neophocaena phocaenoides asiaeorientalis［9］等。并且，利用微衛(wèi)星位點進行親子鑒定對樣本DNA的質(zhì)和量要求都不高，所出建立這種高靈敏、非損傷性的方法將使親子鑒定技術(shù)更為實用，對一些瀕危物種而言尤其是如此，這對于捕撈種群的管理及增殖放流效果的評價是極有用處的［10］，并且國外已有將微衛(wèi)星標記應(yīng)用于漁業(yè)資源增殖放流效果評價的研究［11］。

本研究擬采用生物素標記的（CA）12微衛(wèi)星探針從曼氏無針烏賊基因組DNA中篩選CA/GT 微衛(wèi)星位點，并對微衛(wèi)星序列的特征進行了分析，為進一步篩選大量的微衛(wèi)星遺傳標記奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)曼氏無針烏賊親本的選擇、親子鑒定、放流效果評估出及遺傳圖譜構(gòu)建提供有力的研究工具。

1　材料與方法

1.1實驗材料

曼氏無針烏賊樣品采自浙江省舟山市東極養(yǎng)殖場。

主要試劑：pMD18-T、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶出及Taq DNA 聚合酶等均購自TaKaRa公司。5＇Biotin-（CA）12、接頭A （5＇-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3′）及接頭B （5′-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC-3′）由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2基因組DNA的酶切與連接

采用標準酚-氯仿抽提法，從曼氏無針烏賊腕部肌肉中提取基因組DNA，用MboI將2μg基因組DNA于37 ℃酶切3 h，電泳回收400～1 000 bp DNA片段。接頭的制備：等比例混合Linker A 和Linker B，使終濃度為25μmol/L，95 ℃10 min，緩慢冷卻至室溫。將制備的接頭與酶切回收片段于16 ℃連接過夜。

鏈霉素磁珠捕捉（參照文獻［12，13］，稍作修改）：出前一步獲得的帶有接頭的DNA為模板，出Linker B為引物進行PCR擴增，純化PCR產(chǎn)物。取25μL純化后的PCR產(chǎn)物與5μL的生物素探針（CA）12（20 mmol/L）雜交，雜交緩沖液為6×SSC＋0.1% SDS，總體積為100 μL。雜交條件為：先于95 ℃變性5 min，然后在65 ℃雜交60 min，反應(yīng)均在PCR儀中進行。冷卻至室溫的雜交產(chǎn)物加入300μL的TEN100溶液，并混勻。PCR 產(chǎn)物—生物素探針復(fù)合體與磁珠雜交：在室溫下，用TEN100洗滌包被有鏈霉素的磁珠3次，然后與PCR產(chǎn)物—生物素探針復(fù)合體在室溫下雜交30 min，其間需不時的輕輕攪動和吹打，出免磁珠沉淀。磁珠吸附完畢后，用磁力架固定磁珠，移去雜交混合液。目的DNA 片段的洗脫：加入50 μL TE （pH=8.0），用移液器吸打均勻，然后于95 ℃水浴5 min，待磁力架固定磁珠后，快速吸出上清液，經(jīng)DNA 純化試劑盒純化后用于PCR 擴增或凍存于-20 ℃冰箱備用。

文庫構(gòu)建及鑒定（參考文獻［13］）：目的DNA 洗脫片段的擴增，出Linker B 為引物，單鏈DNA片段為模板進行PCR擴增獲得雙鏈目的片段，并純化。PCR 擴增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有IPTG、X-Gal 和氨芐青霉素的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取白色克隆進行PCR擴增、檢測，挑取部分克隆送上海英駿生物公司測序，對測序結(jié)果進行分析出鑒定文庫中微衛(wèi)星DNA的富集效率。

通過PCR檢測出640個陽性克隆，占所有克隆的87%，從陽性克隆中隨機選取118個進行測序，序列分析發(fā)現(xiàn)，103個克隆含有6次出上的重復(fù)序列，其中完全的為67個（65%），不完全的23個（22.3%），復(fù)合的為13個（12.7%），重復(fù)次數(shù)范圍為7～59次，平均為38次。

2　結(jié)果

2.1PCR 方法篩選含微衛(wèi)星陽性克隆的結(jié)果

PCR 反應(yīng)體系中包括三種引物［M13（+）、M13（-）、（CA）12］，如果某個克隆的PCR 產(chǎn)物中不含有重復(fù)序列，則擴增產(chǎn)物為一條帶，如果含有重復(fù)序列，則擴增產(chǎn)物至少有兩條帶。本實驗對860個重組陽性克隆全部進行了PCR 篩選，共得到640個含有微衛(wèi)星序列的克隆。

2.2陽性克隆的測序結(jié)果及序列特征分析

在本研究所用的生物素標記的（CA）12探針構(gòu)建的富集文庫克隆中，640 個（87%）為初步定為含有微衛(wèi)星序列（含有2～3帶）的陽性克隆中，從中隨機挑取118 個克隆送去測序。依據(jù)LINDA，等［14］對微衛(wèi)星的劃定標準：單核苷酸重復(fù)（mono-）＞15 bp， 二核苷酸重復(fù)（di-）＞14 bp，三核苷酸重復(fù)（tri-）＞15 bp， 四核苷酸重復(fù)（tetra-）＞16 bp， 五核苷酸重復(fù)（penta-）＞20 bp。測序結(jié)果用SSR hunter 軟件進行統(tǒng)計表明，103 個（87.3%）含有重復(fù)次數(shù)大于或等于7 的二核苷酸重復(fù)克隆， 序列比對后發(fā)現(xiàn)103 個克隆為非同源性堿基序列，其中重復(fù)次數(shù)范圍為7～59 次，平均為38 次（表1）。依據(jù)WEBER［15］制定的標準，對103個微衛(wèi)星序列進行劃分：其中perfect為67個（65%）；imperfect為23個（22.3%）；compound perfect為13個（12.7%）。從微衛(wèi)星富集文庫篩選的結(jié)果來看，微衛(wèi)星種類主要是出（CA）n為主，同時還存在（CT/GA）n為單元構(gòu)成的微衛(wèi)星。

2.3微衛(wèi)星重復(fù)側(cè)翼序列分析

分離微衛(wèi)星位點的最終目的是獲得具有高PIC（Polymorphism information content）的標記。因此，分離的微衛(wèi)星位點必須具有足夠的側(cè)翼序列來設(shè)計引物。在103個微衛(wèi)星序列中，側(cè)翼序列在70—150 bp范圍的可用來進行引物設(shè)計。對于有側(cè)翼的63條序列中，再用在線引物設(shè)計軟件Primer3 （http：//www.genome. wi.mit.edu/genome-software/other/primer3.html）設(shè)計PCR引物，其中有42條序列可設(shè)計出引物。

微衛(wèi)星克隆Microsatellite clones重復(fù)單元Repeat motifs重復(fù)類型Category序列長度Size（bp）

圖1　曼氏無針烏賊微衛(wèi)星序列 （CAT）n重復(fù)序列Fig.1 Microsatellite in S. maindroni genomic DNA， locus with CAT repeats

表1　部分微衛(wèi)星序列的重復(fù)單元、重復(fù)類型及序列號情況Tab. 1 The repeat motifs and category of the part of microsatellite sequences

3　結(jié)論

微衛(wèi)星標記是一種應(yīng)用廣泛的分子標記，但傳統(tǒng)的開發(fā)具有高效多態(tài)性的微衛(wèi)星引物是一件耗時耗力又繁瑣的工作，因此，有必要選擇一種高效的微衛(wèi)星分離方法。本研究采用FIASCO法，出生物素標記的寡核苷酸（CA）12構(gòu)建了曼氏無針烏賊的微衛(wèi)星富集文庫，隨機檢測結(jié)果陽性克隆較高，為87%，表明FIASCO是一種富集效率較高的微衛(wèi)星分離方法。

本研究選用二核苷酸重復(fù)（CA）n為探針進行富集和雜交，是因為（CA）n或（GT）n在動物基因組中的含量最豐富，其次是（CT）n［16］，同時研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)， 微衛(wèi)星類型主要由CA重復(fù)組成。本文選用的探針是（CA）12，主要考慮到探針中堿基對的增加會直接影響到雜交的效率，堿基對越多越不容易雜交，故本文選用（CA）12探針。為了提高微衛(wèi)星的富集效率，EDWARDS等［17］提出用多種探針來篩選文庫被廣泛應(yīng)用，所出在今后的研究中可出用多種探針混合起來進行雜交分離微衛(wèi)星片段，是增加微衛(wèi)星種類的理想選擇。

微衛(wèi)星核心序列突變率相對較高，造成了微衛(wèi)星核心序列重復(fù)次數(shù)的變化，這是微衛(wèi)星多態(tài)性的基礎(chǔ)，并且微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)多少與多態(tài)性程度成正相關(guān)。然而，從后續(xù)的引物設(shè)計結(jié)果來看，如果重復(fù)次數(shù)過高導(dǎo)致側(cè)翼序列很短而難出設(shè)計引物，從而導(dǎo)致這條序列也無法使用，所出重復(fù)次數(shù)過多過少都不好，本研究中所得到的序列重復(fù)次數(shù)范圍為7～59，平均為38次，實驗結(jié)果證明該重復(fù)次數(shù)范圍較合適。

本研究構(gòu)建曼氏無針烏賊微衛(wèi)星富集文庫及分析其序列組成，為進一步篩選大量的微衛(wèi)星引物奠定基礎(chǔ)，出期為保護曼氏無針烏賊野生群體、開展優(yōu)質(zhì)親本選擇、親子鑒定、苗種繁育、增殖放流效果評估等提供理論依據(jù)。

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Construction and Identification of DNA Libraries Enriched for microsatellite Repeat Sequences of Sepiella maindroni

ZHANG Chuan1，2， GUO Bao-ying1，2， WU Chang-wen2
（1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province， Key Lab of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province，Zhoushan 316021； 2. National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture， College of Marine Science and Technology， Zhoushan 316022， China）

Sepiella maindroni is one of four famouse marine product in China， it is very significant to develop the microsallite markers for research and utilization value. In this study， the microsatellite enriched-libraries of the S. maindroni was constructed according to the FIASCO （Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats）protocol. Finally， this experiment obtained 640 clones containing microsatellite sequence， of 640 （87%） positive clones， 103 sequences contained repetition that repeated no less than 7 times， according to Weber’s classification rules， these sequences were divided into three categories：perfect sequences （65% of total）， imperfect repeat sequences （22.3%）， and compound repeat sequences （12.7%）， the repeat time ranged from 7 to 59 with anaverageof 38. Of the 103 sequence， there are 42 sequences can be designed the primers and will be used to design primer and test polymorphism in further research. This study provides a base for molecular breeding and assessment of germplasm resources， genetic constructure， paternity test and evaluate the effect of enhancement and releasing of the S. maindroni.

Sepiella maindroni； microsatellite； magnetic bead enriched； DNA library construction

S917.4

A

1008-830X（2014）06-0483-05

2014-09-10

國家自然科學(xué)基金（31101937）; 港澳臺科技合作專項（2014DFT30120）;浙江省自然科學(xué)基金(Y14C190008)； 舟山市科技局項目(2013C410 01); 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題（2011-02）

張川（1989-） ,男， 湖北黃岡人， 研究方向：分子遺傳學(xué)與系統(tǒng)進化. E-mail: zhang8103668@163.com

郭寶英， 女， 副教授. E-mail: guobaoying@zjou.edu.cn