于殿宇 張春艷 宋 鵬 李萬振 解桂東 江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

油脂是食品的重要組成成分，能賦予食品獨特的口感、風(fēng)味和質(zhì)地，但大量攝入會引發(fā)高血脂、心臟病和動脈硬化等慢性病，嚴(yán)重損害人類的健康［1-3］。以往的油脂代用品和模擬品會不同程度地影響人類的基礎(chǔ)代謝，有些產(chǎn)品的風(fēng)味和口感也不易保存［4-5］。因此，開發(fā)特性、口感和風(fēng)味效果與天然油脂相同的功能性油脂已成為各國食品行業(yè)的熱門研究方向［6-8］。即將短鏈脂肪酸和油脂進行酯化，形成的至少包含一個低熱量短鏈脂肪酸和一個不被吸收長鏈脂肪酸（被稱為構(gòu)造脂質(zhì)）的長短鏈三酰甘油［9-10］。因長短鏈脂肪酸具有發(fā)熱量低，可刺激腸道電解質(zhì)和水的吸收等特點，故長短鏈三酰甘油具有降低血糖水平和膽固醇水平的功能［11-12］。低熱量油脂代用品在綜合評分中優(yōu)于以往的油脂代用品和模擬品［13-14］。

近年來，生產(chǎn)低熱量油脂的方法大都是在常規(guī)的方式下進行，不僅生產(chǎn)周期長，且酯化率低，而在化學(xué)隨機酯交換反應(yīng)研究背景下研究的超臨界CO2酶法酯交換反應(yīng)，是近年來生物工程新開拓的領(lǐng)域［15-16］。在這種狀態(tài)下，反應(yīng)物在超臨界CO2流體中的溶解度大，且超臨界CO2流體的傳質(zhì)速率高，進而使反應(yīng)物能與催化劑充分接觸，提高酯化反應(yīng)的速度，大大縮短反應(yīng)時間。這些特點使其在食品工業(yè)上的應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。

本試驗以短鏈脂肪酸與葵花油的甘油酯混合進行酯化反應(yīng)，利用具有更高活性的脂肪酶Lipozyme RM IM，對超臨界CO2狀態(tài)下酶法合成長短鏈甘油酯進行了初步研究，并確定了酯化條件。

1 材料與方法

1.1 試劑

葵花油：金龍魚嘉里糧油（營口）有限公司；脂肪酶Lipozyme RM IM：丹麥諾維信公司；二氧化碳（純度＞99.9%）：哈爾濱黎明氣體有限公司；乙酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：美國sigma公司；正己烷（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸（分析純）、乙酸酐：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀（分析純）：天津光復(fù)精細化工研究所；濃硫酸：固安縣清運化工廠。

1.2 設(shè)備

高壓反應(yīng)釜：江蘇太倉市醫(yī)器械廠；恒溫水浴鍋：上海申生科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪高科儀器廠；低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；7890A型氣相色譜儀：安捷倫公司。CP-Sil 88毛細管柱（100 m×0.25 mm i.d×0.2μm）：美國Varian公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶促酯化方法

向反應(yīng)釜中加入一定比例的乙酸、乙酸酐、葵花油、甘油及一定量的脂肪酶和純凈水，放入轉(zhuǎn)子，進行充分?jǐn)嚢?，確保反應(yīng)物混合均勻。將反應(yīng)釜密封后充入少量CO2以置換出反應(yīng)釜中的空氣，同時試漏，確定反應(yīng)釜密封情況良好不漏氣后，在加壓泵的作用下充入CO2使反應(yīng)釜內(nèi)達到一定壓力，然后將反應(yīng)釜置于水浴鍋中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至200 r／min，在一定溫度下反應(yīng)一定時間。

1.3.2 酯化率的測定分析

取1.3.1中的液體產(chǎn)物3～5滴，稱重，采用無水硫酸鈉過濾除去水分，以1%H2SO4-甲醇甲酯化后溶于正己烷，供氣相色譜分析［17］。乙酸的質(zhì)量含量通過利用乙酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出。

檢測器：FID；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；空氣壓力：50 kPa；氫氣壓力：60 kPa；氮氣壓力：220 kPa；程序升溫：70℃時保持 4 min，然后以13℃／min的升溫速率將溫度升至175℃，保持此溫度27 min，最后以4℃／min的升溫速率將溫度升至215℃，保持31 min。

式中：M0為反應(yīng)初始體系中酸的單位含量；Mt為反應(yīng)完畢后體系的游離酸的單位含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 反應(yīng)壓力對酯化率的影響

固定反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間15 h，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，反應(yīng)壓力分別取8、9、10、11、12 MPa進行酯化反應(yīng)，測定樣品的酯化率。

壓力是超臨界酯化反應(yīng)的主要影響因素，壓力不同必然影響底物濃度從而影響反應(yīng)速率及酯化率。如圖1所示，隨著反應(yīng)壓力的增加，酯化率先增加，后有所下降。隨著壓力的不斷增大，反應(yīng)物與酶接觸面積不斷增大，反應(yīng)速率加快，從而相應(yīng)提高轉(zhuǎn)化率，并縮短了反應(yīng)時間。但當(dāng)壓力達到11 MPa以上時，酯化率略有下降，因此反應(yīng)壓力為11 MPa較為適宜。

2.1.2 反應(yīng)溫度對酯化率的影響

固定反應(yīng)壓力11 MPa，反應(yīng)時間15 h，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，反應(yīng)溫度分別取45、50、55、60、65℃進行酯化反應(yīng)，測定樣品的酯化率。

如圖2所示，隨著溫度的升高，酯化率逐漸增大，當(dāng)達到一定溫度時，再升高溫度，酯化率反而呈下降趨勢。這是由于隨著溫度的增加，一方面，反應(yīng)物在超臨界流體中的溶解度會有很大提高，另一方面，酶的催化效率升高，當(dāng)溫度到達55℃時，酶的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞使其活性逐漸下降，從而影響了反應(yīng)效果。由此可見，此催化酯化反應(yīng)中脂肪酶Lipozyme RM IM的最適溫度在55℃。本試驗選擇反應(yīng)溫度為55℃。

圖2 反應(yīng)溫度對酯化率的影響

2.1.3 反應(yīng)時間對酯化率的影響

固定反應(yīng)壓力11 MPa，反應(yīng)溫度55℃，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，反應(yīng)時間分別取 5、10、15、20、25 h進行酯化反應(yīng)，測定樣品的酯化率。

如圖3所示，隨著反應(yīng)時間的延長，酯化率不斷提高，當(dāng)反應(yīng)時間達到15 h后，酯化率先下降后趨于平緩，這是因為隨著反應(yīng)時間的延長，底物濃度和酶活力開始降低，反應(yīng)速度逐漸減小，酯化率最后趨于平緩，是因為酯化反應(yīng)達到平衡后略向逆反應(yīng)方向進行的緣故。綜合考慮反應(yīng)時間以15 h為宜。

圖3 反應(yīng)時間對酯化率的影響

2.1.4 體系水份添加量對酯化率的影響

固定反應(yīng)壓力11 MPa，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間15 h，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，水分添加量分別取1%、2%、3%、4%、5%進行酯化反應(yīng)，測定樣品的酯化率。

如圖4所示，隨著水分的增加，酯化率先升高后降低，結(jié)合到葵花油中的乙酸含量隨著水分的增加而提高，這是由于少量水的存在，起著增加酶活性的作用，促進酸解反應(yīng)，而且少量水分有利于保持酶活性部位構(gòu)象，使酶充分發(fā)揮活力。當(dāng)水分添加量不足2%時酯化率低，是因為含水量不足以使酶發(fā)揮其最大活性；當(dāng)反應(yīng)體系中水分添加量超過2%時酯化率下降，是由于水量過多時會在酶的活性位點上形成一層水的屏障，阻礙了酶促反應(yīng)的進行。因此，體系水分添加量為2%較為適宜。

圖4 體系水分添加量對酯化率的影響

2.1.5 酶用量對酯化率的影響

固定反應(yīng)壓力11 MPa，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間15 h，水分添加量為2%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，酶用量分別取 1%、2%、3%、4%、5%進行酯化反應(yīng)，測定樣品的酯化率。

如圖5所示，隨著酶用量的增加，酯化率隨之提高后略有下降，原因是隨著酶用量的增加，酶分子與底物接觸的機會增加，反應(yīng)速度加快，酯化反應(yīng)程度提高，但當(dāng)酶用量達到4%后，酯化率略有下降趨勢，這是由于酶量大時，水量不足，水解慢，偏酯的生成量少，限制后續(xù)酯化反應(yīng)，進而對酯化率造成影響。故酶用量選擇4%最為適宜。

圖5 酶用量對酯化率的影響

2.1.6 底物物質(zhì)的量比對酯化率的影響

固定反應(yīng)壓力11 MPa，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間為15 h，水分添加量為2%，酶用量為4%，乙酸與葵花油底物比分別為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進行酯化反應(yīng)，測定樣品的酯化率。

底物比是影響葵花油中短鏈脂肪酸含量的主要因素。如圖6所示，隨著底物比的增加，即結(jié)合到葵花油中的乙酸含量提高，酯化率先升高后降低，當(dāng)乙酸／葵花油的比例達到3∶1時，酯化率最高。當(dāng)?shù)孜锉瘸^3∶1后，酯化率降低，這是因為當(dāng)羧基供體的量持續(xù)增大時，葵花油和酶的含量相應(yīng)降低，可能會因底物抑制或其他（如擴散速度）的限制而影響到葵花油中的乙酸插入量。綜上所述，底物比為3∶1較為適宜。

圖6 底物物質(zhì)的量比對酯化率的影響

2.2 最佳工藝參數(shù)的確定

由單因素試驗可以看出在酯化過程中，水分添加量、酶用量、反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響較大。因此，確定在水分添加量2%，酶用量4%，反應(yīng)溫度55℃基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計（Box-Benhnken），以水分添加量（A）、酶用量（B）和反應(yīng)溫度（C）為自變量，酯化率（R1）為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗。自變量水平編碼見表1，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及試驗結(jié)果

利用Design Expert7.0.0軟件對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3（P＜0.05為顯著項）。

表3 方差分析結(jié)果

通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到酯化率（R1）對水分添加量、酶用量和反應(yīng)溫度（C）的回歸方程為：

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（P＜0.000 1）失擬項不顯著（P＞0.05），并且該模型 R2＝98.53%96.64%，回歸模型與實際情況擬合很好，可以用該模型預(yù)測超臨界CO2狀態(tài)下酶法酯化的實際酯化率情況。圖7～圖9分別給出了酶用量與水分添加量，反應(yīng)溫度與水分添加量，反應(yīng)溫度與酶用量的交互作用對酯化率的響應(yīng)曲面圖。

圖7 水分添加量與酶用量對酯化率影響的響應(yīng)面圖

將反應(yīng)中的反應(yīng)溫度固定在0水平上，可以得到水分添加量和酶用量交互作用對酯化率的影響。由圖7可以看出，加酶量不變時，隨著水分含量的增加，酯化率含量呈現(xiàn)逐漸增加，當(dāng)達到一定值后略有降低的趨勢；水分添加量不變時，隨著加酶量的增加，酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在水分添加量為2%～2.5%，酶用量約為4%時，酯化率在65%以上。

圖8 水分添加量和反應(yīng)溫度對酯化率影響的響應(yīng)面圖

將反應(yīng)模型中的加酶量固定在0水平上，可以得到水分添加量和反應(yīng)溫度交互作用對酯化率的影響。由圖8可以看出，水分添加量不變時，隨著反應(yīng)溫度的增加，乙酸酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；反應(yīng)溫度不變時，隨著水分添加量的增加，酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在水分添加量約為2%～2.5%，反應(yīng)溫度約為55℃時，酯化率在65%以上。

圖9 酶用量和反應(yīng)溫度對酯化率影響的響應(yīng)面圖

將反應(yīng)中的反應(yīng)溫度固定在0水平上，可以得到酶用量和反應(yīng)溫度交互作用對酯化率的影響。由圖9可以看出，反應(yīng)溫度不變時，隨著酶用量的增加，酯化率呈現(xiàn)先增加后略有降低的趨勢；酶用量不變時，隨著反應(yīng)溫度的升高，酯化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在加酶量為4%～4.5%，反應(yīng)溫度約為55℃時，酯化率在65%以上。

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

為檢驗響應(yīng)面方法所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進行試驗，得到的酯化率為65.3%，預(yù)測值與試驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性，表明所得出的回歸方程可以很好的反應(yīng)水分添加量、酶用量和反應(yīng)溫度與酯化率的關(guān)系。

2.3 超臨界狀態(tài)下合成的長短鏈三酰甘油

在超臨界狀態(tài)下，用脂肪酶Lipozyme RM IM催化合成長短鏈三酰甘油。以酯化率為指標(biāo)，以壓力11 MPa，反應(yīng)溫度56℃，反應(yīng)時間15 h，水分添加量為2.5%，乙酸與葵花油底物比為3∶1，酶用量4%的條件下合成長短鏈三酰甘油。在此參數(shù)下進行驗證試驗，試驗結(jié)果顯示酯化率可達65.3%（見圖10，圖11）。

圖10 乙酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)樣的GC圖

圖11 長短鏈甘油酯的GC圖

3 結(jié)論

在超臨界CO2狀態(tài)下，利用脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化反應(yīng)合成長短鏈三酰甘油，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定了最佳的制備工藝：反應(yīng)壓力11 MPa、反應(yīng)溫度56℃、反應(yīng)時間15 h、體系水分添加量2.5%、酶用量4%、底物物質(zhì)的量比3∶1。在最佳條件下進行酯化反應(yīng)，酯化率為65.3%，用此方法制得的長短鏈脂肪酸三酰甘油食用安全，與普通葵花油相比，熱量值降低了大約50%。

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