孫元琳 崔 璨 顧小紅 陳尚衛(wèi) 宋 昱 張隴清

（運城學(xué)院生命科學(xué)系1，運城 044000）

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2，太原 030006）

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室3，無錫 214122）

（山西省農(nóng)科院棉花研究所4，運城 044000）

酚酸（phenolic acid）屬于酚類化合物，多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，主要有阿魏酸、芥子酸、香豆酸和咖啡酸等［1］。酚酸在植物中主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在。近年來，酚酸作為抵抗癌癥和心臟病的潛在保護因子，受到越來越多的關(guān)注，其部分原因在于它們潛在的抗氧化活性、抗癌以及對慢性疾病的保健功效［2］。

全谷物攝入對慢性疾病的預(yù)防作用主要歸功于膳食纖維及其與之共價連接的酚酸類物質(zhì)，被稱為“膳食纖維-酚類抗氧化劑復(fù)合物”，這個觀點已被廣泛接受［3］。阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）是谷物中含量最豐富的酚酸類物質(zhì)，主要以結(jié)合態(tài)存在［4］。研究表明，阿魏酸具有很強的抗氧化活性，并能調(diào)節(jié)人體免疫功能，通過抑制脂質(zhì)氧化、降低血清中膽固醇含量和抗血栓作用預(yù)防動脈粥樣硬化和冠心?。?-8］。

黑小麥?zhǔn)且环N珍貴的黑籽粒小麥品種，屬于優(yōu)質(zhì)特色谷物資源。與普通小麥相比，黑小麥含有更為豐富的膳食纖維、酚酸、花色苷、B族維生素和微量元素等生物活性物質(zhì)，以其特殊的營養(yǎng)價值而備受關(guān)注［9-10］。近年來，國內(nèi)已經(jīng)培育出多個優(yōu)良品種，如河?xùn)|烏麥526、黑小麥76、亞洲1號、秦黑1號和紫晶1號等。但是，針對黑小麥生物活性物質(zhì)的鑒定和功能性評價的研究力度還遠遠不夠。國內(nèi)外科研人員對小麥、黑麥、大麥、玉米、稻谷等谷物中阿魏酸的含量和功能性展開了較為系統(tǒng)的研究［11-13］，對于黑小麥酚酸物質(zhì)的組成和生物活性研究，國內(nèi)外鮮見報道。以黑小麥為原料開發(fā)阿魏酸及其與之相結(jié)合的膳食纖維作為天然保健食品功能因子，對改善人類膳食結(jié)構(gòu)、預(yù)防慢性代謝性疾病有著極其重要的意義。

Rondini等［14］報道，膳食中的結(jié)合態(tài)阿魏酸在腸道以相對較低的濃度被緩慢而持續(xù)的吸收，其效果比攝入游離態(tài)阿魏酸具有更好的生物利用率。本試驗以黑小麥麩皮為原料，對提取的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸進行定性分析，并對結(jié)合態(tài)阿魏酸含量進行測定，為黑小麥特色谷物資源的有效增值和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥（紫?！昂?xùn)|烏麥528”、藍?！昂?xùn)|烏麥526”）和普通小麥（運旱22-33）麩皮：山西省農(nóng)科院棉花研究所提供；阿魏酸：Sigma公司。乙醇、乙醚、甲醇和氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

WATERSMALDISYNAPTQ-TOFMS四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜：美國Waters公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國Agilent公司；756MC型紫外可見光分光光度計：上海精科分析儀器廠；KQ4200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山超聲儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 游離態(tài)酚酸FPA的提取

將原料粉碎，過40目篩，稱取3 g原料放入150 mL具塞三角瓶中，加入75 mL 80%乙醇超聲避光提取15 min，然后在40℃水浴振蕩器振蕩提取3 h，離心（3 000 r／min，20min），上清液用 HCl溶液調(diào) pH＝2，真空濃縮，乙醚萃取，N2揮干萃取液中的乙醚后，用1 mL甲醇復(fù)溶，得到游離態(tài)酚酸樣品FPA［15］。

1.3.2 結(jié)合態(tài)酚酸CPA的提取

提取液離心后的殘渣加入60 mL 2 mol／L NaOH溶液，充N2在40℃水浴振蕩條件下避光提取12 h，離心（3 000 r／min，20 min），上清液用 HCl溶液調(diào)pH＝2，真空濃縮，乙醚萃取，N2揮干萃取液中的乙醚后，用1 mL甲醇復(fù)溶，得到結(jié)合態(tài)酚酸樣品CPA［16］。

1.3.3 酚酸樣品的定性分析

紫外（UV）光譜分析：取適量標(biāo)準(zhǔn)阿魏酸以及制備好的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸樣品分別用甲醇溶解，配制成1 mg／mL溶液進行紫外吸收光譜掃描，掃描波長為200～400 nm。

LC／MS分析：色譜條件 Lichrospher C18柱（5 μm，2.1 mm ×250 mm）；流動相為體積分?jǐn)?shù)10%的乙腈-0.1%的甲酸；梯度洗脫：0～20 min 100% →80%，20～30 min 80%→40%；柱溫30℃；流速0.3 mL／min；檢測波長為325 nm；進樣量5μL。

質(zhì)譜條件：離子源：EIS源；源電壓3.88 kV；錐孔電壓25 V；離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度300℃；質(zhì)量范圍：200～1 000 m／z；光電倍增器電壓700 V；載氣流速4.2 L／h。液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果用 Masslynx V3.1（2）軟件分析。

1.3.4 阿魏酸含量測定

采用HPLC方法。色譜條件：Symmetry C18柱（5μm，3.9 mm ×150 mm）；流動相為乙腈∶水 ＝15∶85；流速 0.8 mL／min；等梯度洗脫；檢測波長為325 nm；柱溫30℃；進樣量5μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密稱取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，配成0.2 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1、5、10、12、15μL標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣液相色譜儀。以進樣量對色譜峰面積作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線為方程 Y＝70.118X-34.095，R2＝0.999。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)阿魏酸的相對保留時間進行對照，并測定阿魏酸含量。每個樣品測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸樣品的紫外光譜（UV）分析

將阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品、游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸樣品進行紫外掃描，紫外吸收光譜如圖1所示。紫外光譜顯示，樣品在286 nm和325 nm處較強的吸收峰為酚酸分子中苯環(huán)的特征吸收。210～250 nm出現(xiàn)的強吸收帶，也表明分子骨架具有環(huán)狀共軛雙鍵體系。經(jīng)比較，2個樣品與阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸收特征峰相似，表明游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸具有與阿魏酸相似的分子結(jié)構(gòu)。

圖1 游離態(tài)酚酸FPA（A）和結(jié)合態(tài)酚酸CPA（B）的紫外吸收光譜

2.2 游離態(tài)酚酸FPA的定性分析

LC／MS是以HPLC為分離手段，以MS為鑒定方法的分離分析方法。液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)合，實現(xiàn)了樣品的分離和鑒定，是對未知物質(zhì)定性分析的強有力工具。圖2為游離態(tài)酚酸樣品的LC／MS總離子流圖及其主峰所對應(yīng)的一級質(zhì)譜圖。圖2a顯示，游離態(tài)酚酸樣品FPA被分離為2個主要組分A和B，保留時間分別為3.83 min和4.17 min。組分A和B的ESI-MS圖譜均顯示相同的負(fù)離子峰m／z：223.1［M-1］-，可以判斷，2種游離態(tài)酚酸物質(zhì)為一對同分異構(gòu)體，且相對分子質(zhì)量為224。

圖2 游離態(tài)酚酸FPA的LC／MS總離子流圖和峰A、峰B的MS圖

圖3是在一級質(zhì)譜圖的基礎(chǔ)上對粒子進行轟擊得到的LC／MS／MS總離子流圖及其主峰所對應(yīng)的二級串聯(lián)質(zhì)譜圖。在ESI-MS／MS條件下，母離子m／z 223.1（［M-1］-）經(jīng)裂解后，發(fā)生鍵的斷裂，生成的碎片離子主要有 m／z 193.1（［M-1］-）、178、149、134，歸屬為阿魏酸，相對分子質(zhì)量為194。碎片離子m／z193.1相對于母離子m／z223.1丟失了2個CH3（m／z 15）。由此，可以確定游離態(tài)酚酸FPA為芥子酸，相對分子質(zhì)量為224。

圖3 游離態(tài)酚酸FPA的LC／MS／MS總離子流圖和峰 A、峰 B的 MS／MS圖

2.3 結(jié)合態(tài)酚酸CPA的定性分析

圖4為結(jié)合態(tài)酚酸樣品的LC／MS總離子流圖及其所對應(yīng)的一級質(zhì)譜圖。圖4c顯示，結(jié)合態(tài)酚酸樣品CPA被分離為2個主要組分A和組分B，保留時間分別為3.76min和4.13min。組分A和組分B的ESI-MS圖譜均顯示相同的負(fù)離子峰，m／z 193.1［M-1］-。準(zhǔn)分子離子 m／z 193.1［M-1］-經(jīng)裂解后，發(fā)生鍵的斷裂，丟失了 CH3（m／z 15）、COOH（m／z 44）等基團，生成的碎片離子主要有 m／z 178、149、134，歸屬為阿魏酸，從而可以判斷2種酚酸組分為一對同分異構(gòu)體。由此，可以確定結(jié)合態(tài)酚酸CPA主要為阿魏酸，相對分子質(zhì)量為194。

圖4 結(jié)合態(tài)酚酸CPA的LC／MS總離子流圖和峰A、峰B的MS圖

2.4 阿魏酸含量測定

采用HPLC對紫粒和藍粒黑小麥麩皮中的結(jié)合態(tài)阿魏酸含量進行測定。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC圖譜見圖5。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰保留時間為10.509 min，樣品的最大吸收峰保留時間與阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰保留時間吻合。對應(yīng)出峰時間，根據(jù)峰面積計算結(jié)合態(tài)阿魏酸含量，結(jié)果如表1所示。

圖5 黑小麥麩皮結(jié)合態(tài)阿魏酸的HPLC圖譜

由表1可知，紫粒黑小麥麩皮的結(jié)合態(tài)阿魏酸含量為2.07 mg／g，與藍粒黑小麥麩皮含量（2.12 mg／g）相近，其含量高于當(dāng)?shù)胤N植的普通小麥麩皮的阿魏酸含量（1.17 mg／g）。

表1 黑小麥麩皮結(jié)合態(tài)阿魏酸含量

3 結(jié)論

對紫粒、藍粒黑小麥麩皮中的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸進行制備。通過紫外光譜判斷2種酚酸物質(zhì)具有與阿魏酸相似的分子結(jié)構(gòu)。采用LC／MS對酚酸樣品進行定性檢測，結(jié)果顯示，游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚酸的相對分子質(zhì)量分別為224和194，由此判斷，黑小麥麩皮中的游離態(tài)酚酸FPA主要為芥子酸，結(jié)合態(tài)酚酸CPA主要為阿魏酸。

采用HPLC對紫粒、藍粒黑小麥麩皮中的結(jié)合態(tài)阿魏酸含量進行測定。結(jié)果表明，紫粒黑小麥麩皮的阿魏酸含量為2.07 mg／g，與藍粒黑小麥麩皮的阿魏酸含量（2.12 mg／g）相近，其含量高于當(dāng)?shù)胤N植的普通小麥麩皮的阿魏酸含量（1.17 mg／g）。

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