劉玉珍，高 飛，馬雪燕，蘇 瑞，魏婷婷，段陽陽，鄧振山

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000）

連翹中具有藥物活性成分內(nèi)生菌的篩選及其拮抗特性的研究

劉玉珍，高 飛，馬雪燕，蘇 瑞，魏婷婷，段陽陽，鄧振山*

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000）

采用組織分離法從連翹枝條中篩選出13株內(nèi)生菌，其中有7株內(nèi)生真菌，6株內(nèi)生細(xì)菌。分別以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為指示菌株，采用平板對峙法對分離出的13株內(nèi)生菌的抗菌活性進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：13株菌種中有10個菌株對1種供試菌具有抑菌活性。其中L－07－01、L－07－09、L－07－12、L－07－13的拮抗效果明顯，L－07－09對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，測量其抑菌圈直徑為10mm。L－07－12對大腸桿菌具有較強(qiáng)抑菌效果，測量其抑菌圈直徑為10mm。對拮抗效果較強(qiáng)的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)后采用雙層打孔法，測定其抑菌效果后證明L－07－13對金黃色葡萄球菌有極強(qiáng)的抑制效果。對拮抗后的指示菌進(jìn)一步鏡檢后，發(fā)現(xiàn)菌體有明顯的溶菌、空洞、畸形等現(xiàn)象。連翹內(nèi)生菌可以產(chǎn)生豐富的具有藥物活性的次生代謝產(chǎn)物，可作為新型藥物的篩選源。

連翹；內(nèi)生菌；藥物活性；拮抗性

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指那些在其生活史中某一段時期生活在活的植物組織中，并不引起植物組織產(chǎn)生明顯病害癥狀的菌［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤［3］、抗?。?］、抗蟲等活性。因此從內(nèi)生菌中篩選次生代謝活性物質(zhì)的研究非?；钴S，并已取得了很多進(jìn)展。內(nèi)生菌是一個生態(tài)學(xué)概念，而非分類學(xué)單位。是植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組成部分。植物內(nèi)生菌不僅將植物作為其棲息場所，而且對寄主有促生、防病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等廣泛的生物學(xué)作用，是植物病蟲害防治，內(nèi)生聯(lián)合固氮菌篩選，誘導(dǎo)抗病性及轉(zhuǎn)基因載體的天然菌源，具有較高的理論研究價值和實(shí)際應(yīng)用價值，已成為微生物和植物學(xué)學(xué)科的研究熱點(diǎn)［5，6］。內(nèi)生菌包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。

近年來，從東北紅豆杉、三尖杉、南方紅豆杉、云南桃兒七、川八角蓮、南方山荷葉中都已分離出了具有抗腫瘤活性物質(zhì)能力的內(nèi)生真菌菌株［7，8］。2003年，陳毅堅(jiān)等從云南紅豆杉樹皮和枝條中分離得到52株內(nèi)生真菌，其中有19株經(jīng)過TLC／HPLC分析產(chǎn)紫杉醇，產(chǎn)量在萬分之一以上的有8株。郭波等從云南長春花植物中分離出21株真菌，其中有4株產(chǎn)長春新堿類似物。李海燕等從桃兒七植株中分離到28株真菌，其中有兩株產(chǎn)鬼臼毒素類似物。王梅霞等用常規(guī)組織分離法從銀杏中分離獲得了33株內(nèi)生真菌，其中有一株能明顯產(chǎn)生銀杏黃酮類化合物［9］。

連翹（Fructus forsythiae）為木犀科植物，主產(chǎn)于我國山西、河南、陜西、山東等地，有清熱解毒，散結(jié)消腫之功效，主治溫?zé)?、丹毒、斑疹、癰腸腫毒、小便淋閉等癥。目前，國外學(xué)者對連翹化學(xué)成分及其藥理作用研究較多，發(fā)現(xiàn)其有多種生理活性，從連翹中提取出了一些成分，如：苯乙醇苷類、五環(huán)三萜類、木脂體及其苷類、揮發(fā)油等物質(zhì)，但有關(guān)其內(nèi)生菌的研究卻鮮見報(bào)道。鑒于此，本文通過對連翹內(nèi)生菌進(jìn)行分離純化，并從中篩選出對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯拮抗作用的菌株，旨在為生物防治、疾病治療等方面提供新的研究途徑和良好的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料的采集

連翹材料均采自延大校園內(nèi)，2014年3月至5月采集連翹側(cè)枝（不帶葉），采樣后立即帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基成分及組成

1）分離純化用的固體培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂20g；水1000mL；pH自然。

2）搖瓶發(fā)酵的液體培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200g；葡萄糖20g；水1000mL；pH自然。

1.1.3 供試病原菌

大腸桿菌（Escherichia coli.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 連翹內(nèi)生菌的分離與純化

1.2.1 組織分離法

取采集新鮮的連翹枝條，用自來水沖洗干凈后帶入無菌操作室用濃度為70％的酒精浸泡3 min→無菌水沖3～4次→濃度為0.1％安替福民漂洗3 min→無菌水沖洗4次。按無菌操作法將上述處理過的材料剪切成0.5 cm的小段，種植于PDA培養(yǎng)基平板上。置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，當(dāng)觀察到實(shí)驗(yàn)材料邊緣有菌絲長出后，挑取其尖端部分，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待長出后進(jìn)行純化。將純化后的菌轉(zhuǎn)入斜面試管保存［10，11］。

1.2.2 表面消毒效果及檢測

在無菌條件下將上述處理過的植物組織用無菌水在培養(yǎng)基上沖洗一次，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，每個樣重復(fù)做3次，檢查是否有微生物長出。

1.2.3 內(nèi)生菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)

1）菌種活化培養(yǎng)

將斜面中保藏的菌株，用接種環(huán)挑取其尖端部分，轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

2）搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)

待平板內(nèi)菌體長出后在無菌條件下取直徑6 mm菌塊接種于已滅菌的PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，每250mL三角瓶中加入60mL培養(yǎng)基，分別置于28℃的搖床120r／min振蕩培養(yǎng)8～10d。

3）發(fā)酵液處理

用移液槍在無菌條件下分別取1mL發(fā)酵液于離心管中，置于高速離心機(jī)中以3000r／min離心3 min，取上清液備用［12］。

1.2.4 連翹內(nèi)生菌的拮抗作用測定

平板對峙法：無菌條件下，在PDA培養(yǎng)基中同一直線上相距5 cm處兩點(diǎn)接種，一點(diǎn)接種直徑5 mm內(nèi)生菌菌塊，另一點(diǎn)接種直徑5 mm供試菌菌塊（直徑9 cm培養(yǎng)皿，20mL PDA／皿）。

設(shè)單接內(nèi)生菌和單接各供試菌的平板作為對照。設(shè)3次重復(fù)，置于28℃恒溫箱培養(yǎng)，觀察。觀察供試菌株與內(nèi)生菌之間是否有拮抗作用，并測量抑菌圈直徑［13，14］。

1.2.5 發(fā)酵液拮抗作用的測定

雙層打孔法：先在平皿底部倒入一薄層PDA培養(yǎng)基（直徑為15 cm的大平皿25 mL）為下層；上層為供試菌懸液與PDA培養(yǎng)基的混合液（30mL為宜），或者直接倒一層PDA培養(yǎng)基（30mL），待PDA冷卻后再將供試菌懸液涂布在上面；然后在上層培養(yǎng)基中用打孔器打孔，孔中加入發(fā)酵液，以PDA培養(yǎng)基為對照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中3～4 d后測量抑菌圈的直徑。對照實(shí)驗(yàn)其他條件相同，孔中加入無菌水［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹內(nèi)生菌的分離純化結(jié)果

從連翹中共分離出13種內(nèi)生菌。其編號L－07－01、L－07－02、L－07－03、L－07－04、L－07－05、L－07－06、L－07－07為內(nèi)生真菌，L－07－08、L－07－09、L－07－10、L－07－11、L－07－12、L－07－13為內(nèi)生細(xì)菌。內(nèi)生菌菌落培養(yǎng)特征描述（見表1）。

由表1可知，這些內(nèi)生菌的基本形態(tài)都不完全相同，其中白色居多，多為不透明的邊緣整齊的菌株。在實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)很多菌株具有產(chǎn)生色素的現(xiàn)象，產(chǎn)生的色素大多為黑色。

經(jīng)表面消毒過程處理后培養(yǎng)，沒有觀察到任何菌落生長。表明經(jīng)過表面消毒過程，樣品表面附生菌影響已經(jīng)消除，分離的菌株均來自于樣品內(nèi)部，且與組織結(jié)合緊密。

表1 不同內(nèi)生菌經(jīng)培養(yǎng)后在PDA培養(yǎng)基上的顏色及特征

圖1 部分菌株對金黃色葡萄球菌的拮抗作用

2.2 連翹內(nèi)生菌拮抗作用測定結(jié)果

由圖1可知：平板中接種了金黃色葡萄球菌單菌落的平板，能明顯看到兩菌之間對峙的地方有明顯抑菌帶。L－07－O9和L－07－13抑菌效果極為明顯，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌幾乎沒有生長。并且形成了極為明顯的抑菌圈。

由表2、表3可知：內(nèi)生真菌中L－07－05、L－07－06對金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯，L－07－01、L－07－05對大腸桿菌的抑菌效果明顯。內(nèi)生細(xì)菌中L－07－09、L－07－13對金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯。L－07－09、L－07－12對大腸桿菌的抑菌效果明顯。

表2 各菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑結(jié)果表

表3 各菌株對大腸桿菌的抑菌圈直徑結(jié)果表

2.3 發(fā)酵液抑菌效果

采用雙層打孔法對平皿對峙實(shí)驗(yàn)中篩選出的至少對一種供試菌株的抑菌圈直徑大于6 mm的菌株發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L－07－13號菌株對金黃色葡萄球菌拮抗效果最明顯，整個平板表面長滿L－07－13號菌株，金黃色葡萄球菌沒有生長。其中L－07－03、L－07－09內(nèi)生菌在平皿表面雖沒有生長，但金黃色葡萄球菌生長顆粒與對照組相比明顯減小。說明L－07－03、L－07－09對金黃色葡萄球菌也有抑制效果，但不太明顯，對照中的平板上長滿大的顆粒狀的金黃色葡萄球菌。

對照培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌為葡萄狀，但經(jīng)拮抗試驗(yàn)后的指示菌金黃色葡萄球菌菌株明顯觀察出菌體發(fā)生變化，由原來的葡萄狀菌體變?yōu)殡x散的單個菌體，且菌體畸形，變?yōu)樵卵罓?、棒狀，菌體發(fā)生自溶、內(nèi)含物外泄呈空心狀等現(xiàn)象（見圖2）。

圖2 菌株L－07－09拮抗后的金黃色葡萄球菌

3 討論

植物內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，對增強(qiáng)宿主植物對環(huán)境適應(yīng)能力具有重要意義，內(nèi)生菌與宿主植物在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中構(gòu)成了一種穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系［10］。本試驗(yàn)采用組織分離法對連翹枝條的內(nèi)生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，共分離出13株內(nèi)生菌，其中有7株內(nèi)生真菌，6株內(nèi)生細(xì)菌。

表面消毒是內(nèi)生菌分離的重要環(huán)節(jié)［16，17］。為確保所分離到的微生物為連翹內(nèi)生菌，試驗(yàn)過程中對所消毒材料沖洗后的無菌水進(jìn)行涂板培養(yǎng)，如在5～7 d內(nèi)沒有微生物生長，則認(rèn)為該材料消毒徹底，證明所分離到的為內(nèi)生菌。但本試驗(yàn)所采用的消毒方法易于殺死植物體內(nèi)微生物，因而所分離到的內(nèi)生菌種類與數(shù)量可能比植物體內(nèi)所含的要少。因此，在進(jìn)行內(nèi)生菌分離過程中，掌握適宜的消毒時間對最終分離到的內(nèi)生菌數(shù)量和種類都有重要作用。

抑菌活性試驗(yàn)表明，所分離菌株中有9株菌對2種供試菌都有不同程度的抑制作用，占總分離菌株數(shù)的69.2％，這與植物內(nèi)生菌具有抑菌活性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道是一致的［18，19］；試驗(yàn)中有4株菌對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，有4株菌對大腸桿菌具有明顯抑菌活性，試驗(yàn)中有2株菌對2種供試菌都有明顯抑制作用，表明藥用植物連翹內(nèi)生菌具有廣泛的抗菌活性，這可能與連翹具有藥用特性有關(guān)，這為篩選具有廣譜和選擇性抗菌藥物提供了資源。

連翹內(nèi)生菌有其特殊之處，又有多方面的應(yīng)用潛力，是一個尚待開發(fā)的微生物資源，尤其是內(nèi)生菌次生代謝途徑與次生代謝產(chǎn)物的研究在其抗菌、抑菌機(jī)制與藥用價值方面有重要的研究意義。因此，對于連翹內(nèi)生菌的研究還需要從以下幾個方面進(jìn)行：對連翹葉、根中內(nèi)生菌的篩選，以獲得更多的菌種資源；對內(nèi)生菌合成途徑及其發(fā)酵產(chǎn)物的成分進(jìn)行研究；對連翹內(nèi)生菌所產(chǎn)生的有效物質(zhì)進(jìn)行藥理和毒理作用的研究，以明確其是否與連翹有效成分具有相同的藥用功效，以便為今后利用內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)天然藥用活性成分提供有力的理論依據(jù)。

［1］Leuchtmann A.Systematics，distribution，and host specificity of grass endophytes［J］.Nat Toxins.1992，1（2）：150－162.

［2］劉紹雄，王娟，王金華，等.一株引起馬來甜龍竹組培污染內(nèi)生菌的分離與鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（8）：1112－1119.

［3］Strobel G，Stierle A.Stierle Da，etal.Taxomyces Andreonae，A proposed new taxon for bulliilliferous hyphomycete associated with pacifie new taxus brevifolia［J］.Mycotaxon，1993，47：71－80.

［4］Yue Q，miller C J.White JF，et al.Isolation and Characterization of fungal inhibitors from Epichlo festucae［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48：4687－4692.

［5］孔慶科，丁愛云.內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子的研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，32（2）：256－260.

［6］楊海蓮，孫曉璐，宋未，等.植物根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗病性的研究進(jìn)展［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2000，30（2）：106－110.

［7］姜威，金文藻，張?jiān)虑?，?東北紅豆杉內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)研究［J］.中國抗生素雜志，1998，23（4）：263－266.

［8］曾松榮，王海坤，徐成東，等.抗癌藥用植物內(nèi)生真菌的潛在應(yīng)用價值［J］.韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，22（9）：123－126.

［9］中藥大辭典.江蘇新醫(yī)學(xué)院［P］.上海：上海人民出版社，1997：2270.

［10］劉麗娟，郝芳芳.白鮮內(nèi)生菌分離與培養(yǎng)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（20）：149－150.

［11］游玲，林娜，郭華，等.山蒼子內(nèi)生真菌多樣性研究［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，38（1）：121－126.

［12］李桂玲，王建鋒，黃耀堅(jiān)，等.幾種藥用植物內(nèi)生真菌抗真菌活性的初步研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2001，28（6）：64－68.

［13］林娜，游玲，郭華，等.山蒼子內(nèi)生細(xì)菌的分離及抑菌活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（6）：3382－3384，3564.

［14］張偉，賈倩，王麗，等.3種沙生藥用植物內(nèi)生真菌的分離鑒定及其拮抗菌株篩選［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2012，33（3）：35－40.

［15］李小俊，成麗霞，吳彥彬，等.拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測定的新方法［J］.生物技術(shù)，2007，17（1）：55－58.

［16］張慧茹，李帥，趙紅月，等.葎草內(nèi)生真菌SS3的分離與鑒定［J］.飼料工業(yè)，2012，33（1）：26－28.

［17］李瑾，張慧茹，劉諾陽，等.金銀花內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性研究［J］.中國抗生素雜志，2010，35（3）：236－240.

［18］Shan T J，Sun W B，Lou JF，et al.Antibacterial activity of the endophytic fungi from medicinal herb，Macleaya cordata［J］.African Journal of Biotechnology，2012，11（19）：4354－4359.

［19］畢江濤，李萍，馬飛，等.瀕危藥用植物沙冬青內(nèi)生真菌分離及其抑菌活性初步研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（30）：40－48.

［責(zé)任編輯 李曉霞］

Screening of Drug Active Products Endophytic from Fructus Forsythiae and Study on Their Antagonism

LIU Yu-zhen，GAO FEI，MA Xue-yan，SU RUI，WEITing-ting DUAN Yang-yang，DENG Zhen-shan*
（College of Life Science，Yanan University，Yanan 716000，China）

Thirteen strains of endophyte were isolated from Fructus forsythiae branches were screened by using organizationmethod separation，including seven strains of endophytic fungi，six strains of endophytic bacteria.Respectively to Staphylococcus aureus，Escherichia colias the indicator strain，on the isolated thirteen strains of endophytic bacteria antimicrobial activity was screened by plate confrontationmethod.The results showed that：thirteen strains in ten strains of one species of tested bacteriawith antimicrobial activity.One obvious antagonistic effectof L－07－01，L－07－09，L－07－12，L－07－13，L－07－09 has a strong inhibitory effect on Staphylococcus aureus，measuring the inhibition zone diameterwas10mm.L－07－12has a strong inhibitory effecton Escherichia coli，measuring the inhibition zone diameter was 10mm.The antagonistic effect of strong strain liquid fermentation and culture after using double diffusion method，the determination of the antagonistic effect after demonstrated that L－07－13 has a strong inhibitory effecton Staphylococcus aureus.To further check of lens of indicator bacteria antagonistic after cells have obvious lysis，empty and abnormal.Fructus forsythiae endophyte can produce abundant secondarymetaboliteswith activities，it can be used as a source of new drugs screening.

Fructus forsythiae；endophyte；drug active；antagonism

10.3969／J.ISSN.1004－602X.2014.04.084

S482.2

A

1004－602X（2014）04－0084－05

2014-11-01

國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310719007）

劉玉珍（1993—），女，福建寧德人，延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院學(xué)生。*通訊作者