劉永亮，王麗娟，王麗娜，李建民，趙雅寧，王 鵬

(1.河北省唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000；3.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山063000)

丁苯酞是我國自行研制的一類治療缺血性腦血管病的新藥，主要成分為消旋正丁基苯酞，具有改善缺血區(qū)微循環(huán)，保護線粒體，改善神經(jīng)細胞能量代謝、抑制神經(jīng)細胞凋亡等作用。腦水腫的發(fā)生是引起急性腦梗死病情加重的主要原因之一，有關(guān)丁苯酞對腦水腫的影響尚未見臨床報道，本研究通過檢測梗死灶周圍皮層基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和磷酸化肌球蛋白輕鏈 (phosphorylation of myosin light chain,p-MLC)的表達，進一步探索丁苯酞治療腦水腫可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組:健康Sprague-Dawley雄性大鼠150只，清潔級,體質(zhì)量280～320g，由河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心提供。按照隨機性原則分為對照組50只、模型組50只和丁苯酞組50只。

1.2 模型制備：各組大鼠給予10%水合氯醛3～5mL/kg腹腔麻醉，模型組與丁苯酞組大鼠尾靜脈注入光敏劑紅四氮唑即玫瑰紅B 150mg/kg，立體定位儀固定大鼠頭部，常規(guī)消毒后，沿正中線切開頭皮，暴露右側(cè)顱骨，于前囟右3mm后2mm處，磨鉆磨除直徑約6mm外層顱骨，綠色冷光源照射30min，縫合皮膚。以實驗動物麻醉清醒后Longa行為學(xué)評分1～3分作為納入標準。對照組鼠尾靜脈注射生理鹽水，只暴露顱骨，磨除外板，照射時間同上。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測：取各大鼠等部位切片3張，經(jīng)二甲苯二級脫蠟各5min，梯度酒精脫水，3%雙氧水室溫10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓熱修復(fù)，后滴加1∶100比例稀釋的MMP-9一抗和p-MLC一抗4℃過夜，次晨取出置常溫，PBS沖洗后，滴加二抗，37℃孵育1h，DAB顯色，水沖洗后蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，包漿黃染。在200倍顯微鏡下隨機選取梗死區(qū)5個視野，用美國Media Cybernetics公司生產(chǎn)的Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)照相后計算每個視野中陽性細胞數(shù)目。

1.4 Western blot 檢測：用細胞裂解液提取各組各時間點大鼠梗死灶周圍腦組織總蛋白，運用考馬·斯亮藍比色法測定各個樣本蛋白含量，上樣量為100μg蛋白。進行15% SDS-PAGE凝膠電泳，NC轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶500稀釋)、山羊抗p-MLC多克隆一抗(1∶500稀釋)、山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)進行雜交。EcL發(fā)光劑3min，曝光、顯影、定影。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對Western blot結(jié)果進行定量分析。以目標的平均灰度值與內(nèi)參的平均灰度值的比值大小作為分析對象進行比較。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-9免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：對照組可見少量被染成棕黃色的陽性細胞。與對照組相比，模型組和丁苯酞組梗死區(qū)周圍陽性細胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，以24h增加最明顯，3d后開始減少，7d后明顯減少。但丁苯酞組陽性細胞數(shù)目明顯少于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 p-MLC免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：對照組可見少量被染成棕黃色的陽性細胞。與對照組相比，模型組和丁苯酞組梗死區(qū)周圍陽性細胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，丁苯酞組陽性細胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 MMP-9 Western bolt結(jié)果：與對照組相比，模型組大鼠梗死灶周圍腦組織MMP-9含量明顯增加，以24h p-MLC增加最明顯，3d后開始減少，7d后明顯減少。丁苯酞組p-MLC含量明顯低于模型組，但高于對照組。見表3。

2.4 p-MLC Western bolt結(jié)果:與對照組相比，模型組大鼠梗死灶周圍腦組織p-MLC含量明顯增加，以24h p-MLC增加最明顯，3d后開始減少，7d后明顯減少。丁苯酞組p-MLC含量明顯低于模型組，但高于對照組。見表4。

GroupsMMP-93h12h1d3d7dControl19.40±2.3019.60±2.7020.20±3.9621.00±2.8320.00±2.35Model28.60±2.70?55.40±3.21?111.80±2.95?75.80±2.86?27.40±3.21?Butylphthalide23.00±2.92?#41.80±2.59?#86.20±1.92?#48.00±4.58?#22.00±2.55?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsmodel group byANOVAofrepeatedmeasurementdata

MMP-9:matrix metalloproteinase-9

Groupsp-MLC3h12h1d3d7dControl41.40±4.1641.80±4.2142.20±4.4342.00±4.2442.60±3.36Model83.00±4.18?101.80±4.97?167.60±4.04?142.60±3.36?71.00±3.74?Butylphthalide65.20±2.86?#87.40±5.13?#130.80±4.55?#120.60±2.97?#58.00±3.39?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsmodel group byANOVAofrepeatedmeasurementdata

p-MLC：phosphorylation of myosin light chain

GroupsMMP-93h12h1d3d7dControl0.174 8±0.009 30.172 5±0.008 90.172 6±0.009 20.174 9±0.008 70.177 4±0.006 7Model0.289 7±0.010 8?0.479 8±0.008 6?0.775 2±0.006 0?0.653 7±0.004 7?0.345 9±0.005 4?Butylphthalide0.243 6±0.008 6?#0.314 9±0.008 1?#0.545 3±0.006 8?#0.392 3±0.008 0?#0.268 5±0.012 8?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsthe model group byANOVAofrepeatedmeasurementdata

MMP-9:matrix metalloproteinase-9

Groupsp-MLC3h12h1d3d7dControl0.181 9±0.007 80.183 7±0.006 40.184 5±0.005 90.184 7±0.004 80.185 7±0.006 6Model0.284 9±0.006 6?0.482 8±0.006 3?0.908 8±0.003 4?0.692 4±0.005 3?0.274 9±0.006 1?Butylphthalide0.227 4±0.009 8?#0.280 3±0.010 2?#0.650 6±0.008 0?#0.434 9±0.006 3?# 0.235 8±0.005 8?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsthe model group byANOVAofrepeatedmeasurementdata

p-MLC：phosphorylation of myosin light chain

3 討 論

急性腦梗死是一種常見的缺血性腦血管病，其發(fā)病率、病死率和致殘率均較高，嚴重危害著人類的生命和健康。腦水腫是急性腦梗死的一種繼發(fā)性病理反應(yīng)，可加重腦梗死癥狀，加重神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。減輕腦水腫可明顯減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，改善患者的預(yù)后，降低病死率和致殘率。因此，探討腦水腫的治療對治療急性腦梗死有非常重要的臨床意義。目前對腦損害后腦水腫的治療主要有限制入水量、脫水、抗自由基，應(yīng)用激素、鈣拮抗劑、興奮性氨基酸受體拮抗劑、鎂離子和腦細胞代謝功能活化劑[1]。本研究利用光化學(xué)法制造局灶性腦梗死大鼠模型，應(yīng)用磁共振成像技術(shù)觀察大鼠腦損傷后大腦T2像的變化，結(jié)果提示腦損傷后6h大鼠大腦皮層T2像即可見明顯的高信號區(qū)，24h高信號區(qū)面積最大，而丁苯酞組T2像高信號區(qū)面積明顯小于模型組，表明丁苯酞對急性腦梗死后腦水腫有明顯的治療作用。

MMP是一種Zn2+依賴性蛋白酶，主要參與調(diào)解細胞外的基質(zhì)成分，臨床上主要參與動脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)等病理過程[2]。其中MMP-9主要存在于腦組織中，與腦血管病的關(guān)系最為密切。Lucivero等[3]研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血清MMP-9濃度在梗死早期明顯上升,1周后下降,但其下降后的水平仍高于對照組，與腦梗死的病情惡化過程相一致，可見MMP-9參與了腦梗死的病理過程。MMP-9可通過攻擊腦血管外基膜的主要成分層黏蛋白和纖黏蛋白，破壞血腦屏障，導(dǎo)致血腦屏障通透性增高，從而加重腦水腫的形成。Gidday等[4]發(fā)現(xiàn)白細胞，特別是中性粒細胞是腦梗死后MMP-9的來源，而MMP-9能促進白細胞的募集，造成繼微血管基底膜層黏蛋白水解后血氧屏障的破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷。另一方面，MMP-9的降解產(chǎn)物能使纖溶酶原水解，生成血管他汀，而血管他汀作為血管抑制性因子，具有對抗血管內(nèi)皮生長因子進而抑制血管新生的作用[5-6]，最終導(dǎo)致腦缺血后的神經(jīng)損傷。研究[7]表明，MMP-9還參與腦梗死出血性轉(zhuǎn)化的病理過程。Amantea等[8]利用原位酶譜法測定大腦中動脈梗死大鼠明膠酶活性，并使用MMP抑制劑GM600l，發(fā)現(xiàn)能明顯減少腦梗死病灶?？梢娨种芃MP-9對腦梗死具有明顯的治療作用。MMP-9成為了人類研究腦梗死治療的新靶點。本研究利用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測梗死灶周圍皮層MMP-9含量變化提示，與對照組相比，急性腦梗死后梗死灶周圍皮層MMP-9含量明顯增加，急性腦梗死后6h MMP-9含量開始增加，1d增加最明顯，3d MMP-9含量開始降低，7d MMP-9含量明顯降低，與Lucivero等[3]研究基本一致。而丁苯酞組大鼠模型梗死灶周圍皮層MMP-9的含量明顯低于模型組，其中以7d效果最明顯。提示丁苯酞可減少梗死灶周圍皮層MMP-9的表達。具體機制可能如下：丁苯酞能明顯減少梗死區(qū)中性粒細胞的數(shù)目，丁苯酞可通過減少中性粒細胞的數(shù)目來減少MMP-9的表達；丁苯酞具有保護線粒體、改善缺血區(qū)能量代謝、改善缺血區(qū)呼吸鏈的功能，丁苯酞可能通過減輕機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)來減少MMP-9的表達。

肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)是血管平滑肌細胞骨架結(jié)構(gòu)的主要成分，參與維持細胞骨架結(jié)構(gòu)的收縮力和細胞間連接的完整性。MLC磷酸化為p-MLC，可導(dǎo)致細胞骨架結(jié)構(gòu)收縮力增強，內(nèi)皮通透性增高，加重腦水腫的形成。MLC是Rho信號通路下游的主要蛋白，其磷酸化水平主要通過Rho信號通路進行調(diào)節(jié)[9]。王志等[10]研究表明，急性腦梗死后可通過多種途徑激活Rho信號通路，導(dǎo)致肌球蛋白磷酸酶激活，進而導(dǎo)致Rho信號通路下游效應(yīng)分子MLC磷酸化水平增高，肌動球蛋白的收縮性增加，使細胞收縮，從而破壞血管內(nèi)皮細胞的屏障功能，導(dǎo)致血腦屏障通透性增高，加重腦水腫的形成。本研究顯示急性腦梗死后MLC磷酸化水平明顯增高，參與了急性腦梗死后腦水腫形成的病理過程。婁四龍等[11]研究提示應(yīng)用Rho信號通路抑制劑法舒地爾可抑制MLC的磷酸化，進而可減輕腦損傷后腦水腫的形成。而本研究顯示丁苯酞也可通過減少MLC的磷酸化來減輕腦水腫的形成。Doe等[12]發(fā)現(xiàn),Rho 激酶抑制劑可能通過抑制巨噬細胞、白細胞介素6 mRNA 的轉(zhuǎn)錄,減少白細胞介素6、白細胞介素1和腫瘤壞死因子α等炎癥細胞因子的產(chǎn)生。此外，丁苯酞具有抑制腦缺血患者血清C反應(yīng)蛋白表達的作用[13]。而唐淑俊等[14]研究表明，炎性細胞因子和C反應(yīng)蛋白與腦梗死后腦水腫的關(guān)系密切。推測丁苯酞可能正是通過抑制炎癥反應(yīng)的形成來抑制Rho激酶的激活，從而減少MLC的磷酸化水平和減輕腦水腫形成的。

綜上所述，丁苯酞對局灶性腦梗死大鼠腦水腫有明顯的治療作用，丁苯酞可能是通過減少梗死灶周圍MMP-9的表達，減輕MMP-9對腦血管層黏蛋白和纖黏蛋白的破壞，減輕血腦屏障的破壞，從而減輕腦水腫的形成。

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