高 強(qiáng)，許 鵬，郭巖松，馮騰飛，黎 瑋

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050000)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢，而其中60%～85%為透明細(xì)胞癌[1]。腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)惡性程度較高，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且對放化療不敏感[2]。因此，探討RCCC的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制對其診斷、治療、預(yù)后等方面具有重要價(jià)值。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor，Nrf2)是抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子(cap-n-cohar，CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族中調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，醌氧化還原酶(triphosphopyridine nucleotide quinine oxidoreductase，NQO1)是Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidant response elermenty,ARE)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中下游表達(dá)蛋白[3]。研究[4]表明，Nrf2/NQO1信號(hào)通路在呼吸、消化、神經(jīng)、心血管系統(tǒng)等多種器官的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而Nrf2、NQO1表達(dá)水平及其活性變化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。但Nrf2、NQO1在RCCC中的表達(dá)目前尚無報(bào)道。本研究觀察Nrf2、NQO1蛋白和mRNA在RCCC組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，探討其在RCCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2012年1月—2013年1月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科住院行RCCC手術(shù)的患者52例，男性31例，女性21例，年齡37～82 歲，平均(56.13±13.98)歲。均已經(jīng)過病理證實(shí)為RCCC，所有患者術(shù)前均未行放療、化療及其他非手術(shù)治療。對照腎組織21例為癌旁>4cm的腎組織(病理學(xué)證實(shí))。標(biāo)本分為2份，1份以10%福爾馬林固定，常規(guī)包埋、切片，另1份標(biāo)本收集后立即以液氮進(jìn)行快速冷凍并保存在-80℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：Nrf2兔多克隆抗體(1∶100稀釋)和NQO1山羊多克隆抗體(1∶150稀釋)(Santa Cruz公司)；Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒和DNA標(biāo)記物(TaKaRa公司)，引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定：52例RCCC及21例癌旁組織采用免疫組織化學(xué)檢測，嚴(yán)格按照試劑盒使用程序進(jìn)行。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，逐級(jí)脫水，中性樹脂封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照。以胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或者棕黃色顆粒為陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)，每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野均計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，結(jié)合表達(dá)情況應(yīng)用改進(jìn)的雙評分半定量法評分，0～15%計(jì)為0分,>15%～30%計(jì)為1分，>30%～50%計(jì)為2分，>50%～80%計(jì)為3分，>80%～100%計(jì)為4分； 細(xì)胞未著色記作0分，淡黃色記作1分，黃色或棕黃色記作2分，棕黃色記作3分。2種計(jì)分相乘，得分0～3分作為陰性(-)表達(dá)，得分4～12分作為陽性(+)表達(dá)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)半定量分析：36例RCCC及14例癌旁組織采用RT-PCR檢測。引物序列，Nrf2上游引物5′-TATAGCGTG CAAAC CT CGCC-3′，下游引物5′-AAGTGACTGAAACGTAG-CCG-3′，擴(kuò)增片段為550bp；NQO-1上游引物5′-AGGACCCTTCCGGAGTAAGAA-3′，下游引物5′-GTCAGGGAAGCCTGGAAAGA-3′，擴(kuò)增片段為 488bp；β-actin上游引物5′-CTTCCAGCCTTCCTTCC-TGG-3′，下游引物5′-TTCTGCATCCTGTCGGCAAT-3′，擴(kuò)增片段為162bp。按照Trizol試劑使用說明書提取冰凍組織中的RNA，檢測其濃度及純度，用PE基因擴(kuò)增儀行逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增，并行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)為標(biāo)準(zhǔn)片段作標(biāo)記，應(yīng)用紫外透射儀觀察并用數(shù)碼相機(jī)照相電泳后條帶，并應(yīng)用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析目的電泳條帶，參照相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶，結(jié)果以兩者積分吸光度的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 組織化學(xué)檢測結(jié)果：在RCCC組織及其癌旁組織中均有Nrf2、NQO1蛋白表達(dá)。RCCC組織中Nrf2蛋白、NQO1蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，為黃色或棕黃色顆粒。癌旁組織中Nrf2蛋白、NQO1蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，為淡黃色顆粒(圖1，2)。Nrf2蛋白在RCCC組織表達(dá)明顯高于癌旁組織，陽性表達(dá)率分別為76.9%和28.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.005，P<0.01)；NQO1蛋白在RCCC表達(dá)亦高于癌旁組織，陽性表達(dá)率分別73.1%和23.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.999，P<0.01)。Nrf2與NQO1蛋白在RCCC組織中表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.594，P<0.05)。見表1，2。

2.2 RT-PCR結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳顯示，550bp為Nrf2目的條帶，488bp處為NQO1目的條帶，162bp處為內(nèi)參目的條帶。半定量分析結(jié)果顯示，RCCC中Nrf2和NQO1mRNA相對表達(dá)量分別為0.767±0.125和1.025±0.148，而在在癌旁組織中的相對表達(dá)量為分別為0.299±0.025和0.181±0.051，即RCCC組織中Nrf2和NQO1mRNA相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.807、16.197,P<0.05)。

表1 Nrf2和NQO1蛋白在癌旁組織和RCCC組織的表達(dá)Table 1 Expression of Nrf2 and NQO1 protein in RCCC and pericarcinomatous tissues (n，%)

Nrf2：nuclear factor E2-related factor；NQO1：triphosphopyridine nucleotide quinine oxidoreductase

表2 Nrf2和NQO1在RCCC表達(dá)的相關(guān)性Table 2 Correlation between the expression of Nrf2 and NQO1 in RCCC (n，%)

Nrf2：nuclear factor E2-related factor；NQO1：triphosphopyridine nucleotide quinine oxidoreductase

3 討 論

機(jī)體內(nèi)各種應(yīng)激因素在腫瘤細(xì)胞生長過程中持續(xù)出現(xiàn)，從而使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激即內(nèi)源性應(yīng)答反應(yīng)，輕度氧化應(yīng)激可使細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性變化如存活、增殖、分化等，而重度氧化應(yīng)激則可能造成細(xì)胞的損傷性變化如增殖異常、增殖阻滯、衰老、凋亡和壞死等，從而導(dǎo)致腫瘤等一些疾病的發(fā)生[5-6]。Nrf2是人體完整的內(nèi)源性應(yīng)答反應(yīng)即抗氧化系統(tǒng)的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，作為感受器感受氧化應(yīng)激，是細(xì)胞內(nèi)對抗氧化應(yīng)激最重要的機(jī)制[3-4]。在正常情況下，Nrf2以異源二聚體的形式與其抑制物Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)存在于細(xì)胞質(zhì)中，一些因素使其激活后，二者即發(fā)生分離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游抗氧化酶基因NQO1的表達(dá)，引起氧化應(yīng)激和還原循環(huán)的活性醌類及其衍生物抗氧化及解毒[3-4]。Kim等[7]研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和Nrf2活性損害引起抗氧化酶和解毒酶的表達(dá)下調(diào)。表明在腫瘤的形成和細(xì)胞增殖過程中，與氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。而目前已有研究[3-8]發(fā)現(xiàn)多種藥物的抗氧化及抗炎作用是通過Nrf2/ NQO1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。對甲狀腺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤的研究[8-10]發(fā)現(xiàn)Nrf2的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)水平上調(diào)。提示Nrf2/NQO1的抗氧化效應(yīng)在腫瘤的發(fā)展過程中扮演著重要角色。

本研究從蛋白水平及mRNA水平檢測了Nrf2和NQO1在RCCC組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，初步證實(shí)Nrf2和NQO1在RCCC中的表達(dá)升高，同時(shí)Nrf2與NQO1呈正相關(guān)，這一結(jié)果與Nrf2和NQO1在其他惡性腫瘤中的表達(dá)情況基本一致[8-10]。由此推測，Nrf2和NQO1在RCCC細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，通過激活該通路，誘導(dǎo)Nrf2高表達(dá)，促進(jìn)NQO1表達(dá)，使細(xì)胞對氧化應(yīng)激的耐受性增強(qiáng)，進(jìn)而可能在RCCC的發(fā)生發(fā)展中起作用。因此，Nrf2和NQO1信號(hào)通路有望成為治療RCCC的新靶位，將為RCCC的早期檢測和治療開辟新的道路。(本文圖見封二)

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