宋曉宏， 沙 偉

(1.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 涪陵 408100;2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006)

苔蘚植物是自然界的拓荒者之一，在長期的進化過程中許多耐旱蘚類植物形成了特殊的形態(tài)、細胞及大分子等特征，具有很強的耐旱能力，并且在復(fù)水過程中可誘導(dǎo)啟動恢復(fù)機制，如叢本蘚(Anoectangium compactum)和土生蘚類(Tortula ruralis)，經(jīng)受幾個月甚至幾十年的干旱仍能保持生命力［1-2］。國外從20世紀70年代起開始研究苔蘚植物抗旱性，其中以土生墻蘚研究較多，已有大量關(guān)于其應(yīng)對嚴重的水分和干旱脅迫的生理學(xué)、生物化學(xué)、細胞響應(yīng)及分子生物學(xué)的研究［3-6］。毛尖紫萼蘚(Grimmia pilifera)是紫萼蘚屬(Grimmia)中典型旱生植物，生長在向陽的裸巖上，久旱而不喪失生活力，是很好的抗旱資源。本研究從已構(gòu)建的毛尖紫萼蘚耐旱cDNA文庫中篩選4個干旱脅迫誘導(dǎo)表達的基因，分析其在干旱及復(fù)水條件下的表達模式，試圖找到重要的抗旱相關(guān)基因，為研究毛尖紫萼蘚抗旱分子機制提供初步的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

毛尖紫萼蘚采自黑龍江省北部五大連池風(fēng)景區(qū)的老黑山。清洗后在自然光照條件下，保持水分充足，室溫培養(yǎng)7～10 d至生理指標［質(zhì)膜透性、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸含量等］穩(wěn)定，作為對照材料。然后停止?jié)菜M行干旱處理，依據(jù)已有對毛尖紫萼蘚干旱及復(fù)水過程中抗旱相關(guān)生理指標測定結(jié)果選擇取材范圍［7］，分別取干旱 1 d、3 d、5 d，再復(fù)水 0 h、0.5 h、1.0 h、6.0 h、12.0 h、24.0 h、36.0 h、48.0 h共11個時間點材料，液氮速凍后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

蘚類植物普遍含有萜類、固醇類、酚類等次生代謝產(chǎn)物，使提取的 RNA易于降解。為此在 SDS法［8］基礎(chǔ)上加以改進，液氮研磨過程中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和抗壞血酸(VC)粉末，裂解步驟中加入終濃度20%的乙醇，沉淀步驟用1/2體積8 mol/L LiCl和1/2體積75%乙醇，-20℃沉淀30 min。RNA純化使用RQ1 RNase-free DNas試劑盒。cDNA合成采用Promega公司的M-MLV RT試劑盒，合成方法參照說明書進行。

1.3 候選基因及引物設(shè)計

通過生物信息學(xué)分析，從毛尖紫萼蘚耐旱cDNA文庫［9］中選取與活性氧清除、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運及離子平衡相關(guān)的過氧化氫酶相似基因(GpCAT)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相似基因(Gp-PAK)、H+-ATP酶相似基因(GpATP)和蔗糖合成酶相似基因(GpSuSy)進行表達分析。根據(jù)這4個基因的EST序列，結(jié)合熒光定量PCR引物設(shè)計原則，采用Primer express v3.0軟件設(shè)計定量PCR引物。引物序列見表1。

1.4 候選基因表達分析

以18SrRNA作為內(nèi)參基因，設(shè)置空白對照，每個反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。分別以對照和11個時間點材料cDNA為模板，采用熒光定量PCR分析各基因在干旱及復(fù)水條件下的表達。熒光定量PCR使用TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒在伯樂公司的Chromo4熒光定量PCR儀上進行，試驗數(shù)據(jù)采用OpticonMonitor3軟件自動分析。

表1 候選基因熒光定量PCR引物序列Table 1 Fluorescence quantitative PCR primer sequences of the candidate genes

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱條件下基因的表達

以復(fù)水培養(yǎng)7～10 d的毛尖紫萼蘚材料中基因表達量作為對照，并定義為1個單位，干旱條件下各基因表達量如圖1所示。4個基因在干旱條件下基因表達均上調(diào)，干旱5 d時GpCAT、GpPAK、GpATP和GpSuSy基因表達量分別達到對照的3.5、3.7、4.6和3.2倍，說明4個候選基因均受干旱誘導(dǎo)表達。在毛尖紫萼蘚抵御干旱的過程中，GpPAK作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，通過可逆的蛋白質(zhì)磷酸化過程在細胞內(nèi)外形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;GpCAT作為活性氧清除酶系統(tǒng)的一員發(fā)揮作用，使細胞免于遭受H2O2的毒害;GpATP調(diào)節(jié)植物離子及滲透物質(zhì)平衡;GpSuSy調(diào)控蔗糖的合成，從而維持細胞膨壓，保證其正常生長。

2.2 復(fù)水條件下基因的表達

復(fù)水條件下各基因表達量如圖2所示。復(fù)水初期(0.5至1.0 h)，4個基因均表達下調(diào)，但之后表達水平各異。其中，GpCAT基因復(fù)水后1.0 h表達水平開始大幅上升并呈波動變化，至復(fù)水后48.0 h表達量仍為對照的2倍;GpSuSy基因復(fù)水后0.5 h表達水平迅速下降，并逐漸恢復(fù)到對照水平;GpATP基因復(fù)水后1.0 h表達量大幅上升，復(fù)水24.0 h時表達量最高，為對照的7.3倍，干旱5 d的1.6倍;GpPAK基因復(fù)水后與其他基因相比在短時間內(nèi)表達量有較大幅度升高，復(fù)水6.0 h表達量最高，達到對照的4.2倍，之后逐漸下降到對照水平。說明并不是所有基因都受復(fù)水誘導(dǎo)表達，有些基因可能對毛尖紫萼蘚復(fù)水后快速恢復(fù)生長發(fā)揮作 用，并且分別作用于復(fù)水后的不同時期。

圖1 干旱過程中基因的表達模式Fig.1 Expression profiles of drought stress induced genes during dehydration

圖2 復(fù)水過程中基因的表達模式Fig.2 Expression levels of drought stress induced genes during rehydrationn

3 討論

耐旱蘚類具有特殊的形態(tài)、細胞及大分子等特征，既可以適應(yīng)緩慢干旱脅迫，又可以抵御快速干旱造成的傷害，復(fù)水后幾秒鐘外部形態(tài)特征即可恢復(fù)正常，并很快恢復(fù)生長，區(qū)別在于緩慢干旱后復(fù)水生理代謝恢復(fù)速度很快，而快速干旱后復(fù)水要較長時間恢復(fù)。Hinshiri等［10］研究牛舌蘚(Anomdonviticu losus)和光萼苔(Porella pltyphylla)時發(fā)現(xiàn)，緩慢干旱8～9 d后再復(fù)水，兩種苔蘚的呼吸和光合速率可迅速達到正常水平，積極的碳平衡幾乎在瞬間建立。

植物干旱后復(fù)水能繼續(xù)生長也是抗旱性的一種表現(xiàn)，多數(shù)復(fù)蘇植物可以在復(fù)水24 h后恢復(fù)正常代謝水平［11-12］，并且復(fù)水后的基因表達與干旱脅迫時的基因表達是一個連續(xù)的過程，很多基因的表達具有連續(xù)性，在復(fù)水過程中依然起到重要作用［13-14］。耐旱蘚類復(fù)水時基因表達有很大變化，Oliver等［15-16］對土生墻蘚的研究結(jié)果表明，復(fù)水時蛋白質(zhì)的合成受到巨大影響，其中25種蛋白質(zhì)合成終止或大幅度下降，74種蛋白質(zhì)合成開始或大幅度上升，這2組蛋白質(zhì)分別被稱為Hydrins和Rehydrins。在復(fù)水延長期，Rehydrins和Hydrins的合成在恢復(fù)至正常水平的過程中也有所不同，在水化后2～4 h內(nèi)，幾乎所有Hydrins的合成達到正常水平，而一些Rehydrins僅合成不到2 h，另一些10～12 h后仍呈上升趨勢，24 h后所有蛋白質(zhì)均達到正常水平［17］。因此也有學(xué)者［18］推測，復(fù)水早期的Rehydrins蛋白質(zhì)可能參與修復(fù)質(zhì)膜損傷，而復(fù)水延長期間的Rehydrins蛋白質(zhì)則可能參與細胞器結(jié)構(gòu)和功能的長期恢復(fù)過程。本研究中，GpSuSy基因在復(fù)水后表達量大幅下降，推測其可能為編碼Hydrins的基因;GpPAK和GpATP基因在復(fù)水后表達量高于干旱處理，分別在復(fù)水6 h和24 h時達到最高，推測它們?yōu)榫幋aRehydrins的基因，主要受復(fù)水誘導(dǎo)，在再水化恢復(fù)過程中對細胞的質(zhì)膜氧化損傷及細胞器的結(jié)構(gòu)功能進行修復(fù);GpCAT基因在干旱及復(fù)水條件下都有很高的表達量，無法判斷其是編碼Rehydrins或Hydrins的基因，但證明了毛尖紫萼蘚與土生墻蘚有類似的特點，干旱及復(fù)水條件下某些基因表達具有連續(xù)性。

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