賈曉玲，王 楓，馬 靜， 劉 君，徐馨琰，熊愛(ài)生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，韌皮部主要負(fù)責(zé)植物體內(nèi)水分、無(wú)機(jī)鹽和光合產(chǎn)物的運(yùn)輸，并兼有維持植物形態(tài)、抵御外界物理傷害的作用［1-3］。韌皮部蛋白質(zhì)PP2(Phloem protein 2)是植物韌皮部汁液中富含的一種蛋白質(zhì)，是一種特殊的結(jié)合幾丁質(zhì)的凝集素，具有韌皮部組織特異性［4］。同時(shí)，韌皮部蛋白質(zhì)在植物大分子運(yùn)輸系統(tǒng)中起很重要的標(biāo)記作用［5］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)韌皮部蛋白質(zhì)的研究比較早。1995年，Toyama等從甜瓜、黃瓜等幼苗中克隆出編碼PP2亞基的 cDNA［6］。1992 年，Bostwick等對(duì)筍瓜PP2分別進(jìn)行原位雜交與免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)定位，發(fā)現(xiàn)PP2的mRNA特異性地定位于韌皮部伴胞中，PP2蛋白質(zhì)分布于伴胞和篩管分子中［7］。分析南瓜屬的幾個(gè)不同品種，發(fā)現(xiàn)PP2由一個(gè)小的基因家族構(gòu)成，高度保守［8］。利用韌皮部特異表達(dá)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)目的基因在韌皮部高效的表達(dá)，可更經(jīng)濟(jì)、有效地發(fā)揮某些目的基因的作用［9-11］。

芹菜(Apium graveolens L.)屬傘形科草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸地區(qū)，漢代傳入中國(guó)，距今已有2000多年的栽培歷史，是中國(guó)非常重要的蔬菜作物之一［12］。芹菜富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，莖葉等營(yíng)養(yǎng)組織中還含有揮發(fā)油、芹菜苷、佛手苷內(nèi)酯等藥用成分，具有降血壓、調(diào)血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等藥理功效，越來(lái)越受人們的親睞［13-14］。六合黃心芹是南京市六合區(qū)的地方優(yōu)良品種，株高較矮，株型半直立，產(chǎn)量高，品質(zhì)佳，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，可四季栽培［15］。津南實(shí)芹是天津市津南區(qū)選育的優(yōu)良地方品種，植株高大，株型緊湊直立，基本無(wú)分枝，抗性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，中國(guó)南北四季均可栽培。美國(guó)西芹從美國(guó)引進(jìn)，經(jīng)多代提純選育而成，株高高大，株型緊湊，抗病性好，產(chǎn)量高，適合保護(hù)地及春秋露地栽培。芹菜中的AgPP2-2基因主要編碼芹菜中的韌皮部蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在維持芹菜的形態(tài)特征、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面有重要作用。目前相對(duì)于其他模式植物和大宗蔬菜，傘形科的芹菜AgPP2-2基因的研究很少。

本試驗(yàn)分別從六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹中克隆韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因，對(duì)其進(jìn)行較為詳細(xì)的序列分析，利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行不同組織及不同逆境處理下的表達(dá)研究，為進(jìn)一步深入研究芹菜中韌皮部蛋白質(zhì)的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒與試驗(yàn)材料

大腸桿菌菌種DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒載體pMD18-T vector、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品、Ex Taq PCR聚合酶和各類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶等均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

試驗(yàn)材料六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹均由本實(shí)驗(yàn)室保存。2012年秋季將3種芹菜分別種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院江浦實(shí)驗(yàn)園藝場(chǎng)，冬季將其移至南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)大棚，使其安全過(guò)冬春化，并生長(zhǎng)發(fā)育為具有根、莖、葉、花的完整植株。2013年3月，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室分別播種3種芹菜，待植株長(zhǎng)成2月齡大小時(shí)，分別對(duì)其進(jìn)行20%PEG(Polyethylene glycol，聚乙二醇)處理、200 mmol/L NaCl處理、4℃低溫處理、38℃高溫處理，處理時(shí)間均為2 h。

1.2 基因組DNA和總RNA的提取及cDNA的合成

采集成熟芹菜植株的根、莖、葉、花以及不同處理的2月齡芹菜植株幼嫩葉片，用于基因組DNA和總RNA的提取及cDNA的合成。基因組DNA的提取按照DNA試劑盒(DNA simple Total DNA Kit，北京Tiangen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;總RNA的提取按照RNA試劑盒(RNA simple Total RNA Kit，北京Tiangen公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;用Prime Script RT reagent Kit(大連 T aKaRa公司)將提取的總 R NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因的克隆

以GenBank中來(lái)源于旱芹(A.graveolens var.dulce)的韌皮部蛋白質(zhì)(AY114140)的cDNA序列作為芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因克隆引物的參考序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物:NRX19(5'-ATGGCTCAAGTGCAGCGAGATG-3')和NRX20(5'-TTAGCAGATAACTGGCACAATG-3')。分別以六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的 DNA和cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR為50μl反應(yīng)體系:Premix Ex Taq 25 μl，模板 DNA 2 μl，引 物 NRX19(20 μmol/L)1 μl，引物 NRX20(20 μmol/L)1 μl，滅菌蒸餾水21μl;PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收后，連接到pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，菌液經(jīng)PCR鑒定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

各類(lèi)植物的韌皮部蛋白質(zhì)或相似蛋白質(zhì)序列均來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。采用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比較，用MEGA 5.0構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［16］。氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析用網(wǎng)站(http://web.expasy.org)相關(guān)軟件完成［17］。蛋白質(zhì)親水性/疏水性及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用DNAMAN軟件。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)

熒光定量PCR采用ABI 7300 Real-time PCR System 和7300 System software，使用Real-Time PCR Kit(SYBR Green)試劑盒(Shanghai Novland Co.，Ltd)，按照操作說(shuō)明進(jìn)行。芹菜actin基因?yàn)閰⒖蓟?，與目標(biāo)基因一起擴(kuò)增，表達(dá)檢測(cè)引物為ACTIN-F(5'-CTTCCTGCCATATATGATTG-3')和 ACTIN-R(5'-GCCAGCACCTCGATCTTCATG-3')。根據(jù)六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹中分離的芹菜韌皮部蛋白質(zhì) AgPP2-2基因序列，設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物NRX19BDF(5'-TCGTCCCAACGGAAGCACTGAA-3')和NRX19BDR(5'-ACCAACCTTAAGTCCCACCCAT-3')。以芹菜中actin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平為內(nèi)參，目的基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的計(jì)算公式為2-CtΔ，CtΔ=Ct(目標(biāo)基因) － Ct(actin)［18-19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因的克隆

以六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的DNA為模板，用引物NXR19和NXR20，經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別得到約800 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。以上述3個(gè)芹菜品種cDNA為模板，用引物NXR19和NXR20，經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別得到約600 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。序列測(cè)定與分析結(jié)果表明，來(lái)源于3個(gè)芹菜品種的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因均含有1個(gè)540 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼179個(gè)氨基酸。來(lái)源于3個(gè)芹菜品種的AgPP2-2基因在核苷酸水平上有4個(gè)堿基的差異，分別為117位G/A/G(六合黃心芹/津南實(shí)芹/美國(guó)西芹)、206位C/C/T、468位 G/G/A和588位G/T/G;編碼的氨基酸有3個(gè)位點(diǎn)的差異，分別為39位Gly/Arg/Gly、56位Gly/Gly/Arg和62位Trp/Cys/Trp(圖2)。來(lái)源于六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因均含有196 bp和167 bp的內(nèi)含子(圖3)。

圖1 芹菜AgPP2-2基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of AgPP2-2 from celery

2.2 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的氨基酸序列分析

圖2 三種芹菜韌皮部蛋白質(zhì)基因AgPP2-2核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of gene sequences and amino acid sequences of phloem protein gene AgPP2-2 from three celery cultivars

圖3 六合黃心芹AgPP2-2基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide acid and deduced amino acid sequence of phloem protein gene AgPP2-2 from celery Liuhehuangxinqin

對(duì)六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的氨基酸序列進(jìn)行BLAST同源性檢索與比對(duì)，結(jié)果顯示AgPP2-2蛋白質(zhì)與毛果楊(Populus trichocarpa)、粟(Setaria italica)、桃(Prunus persica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、忽地笑(Lycoris aurea)、葡萄(Vitis vinifera)、二穗短柄草(Brachypo-dium distachyon)、南瓜(Cucurbita argyrosperma)、筍瓜(Cucurbita maxima)、番茄(Solanum lycopersicum)、野草莓(Fragaria vesca)、烏拉爾圖小麥(Triticum urartu)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)和水稻(Oryza sativa)的韌皮部蛋白質(zhì)相似度較高。其中與毛果楊的韌皮部蛋白質(zhì)相似性達(dá)到44%。六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2都具有PP2超家族保守結(jié)構(gòu)域(圖4)。將六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2與上述植物中的韌皮部蛋白質(zhì)或相似蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示上述植物中的韌皮部蛋白質(zhì)在保守區(qū)域有6個(gè)亮氨酸殘基和5個(gè)色氨酸殘基，另外，還有2個(gè)纈氨酸、2個(gè)甘氨酸、2個(gè)脯氨酸、1個(gè)酪氨酸和1個(gè)賴(lài)氨酸殘基完全保守(圖4)。

圖4 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的保守域預(yù)測(cè)及其與其他物種類(lèi)似蛋白質(zhì)氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.4 Prediction of the conserved domain and alignment of amino acid sequences of phloem protein AgPP2-2 from celery and other different plants

2.3 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步分析從六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹中分離的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2與其他物種中韌皮部蛋白質(zhì)或相似蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)檢索結(jié)果，選取上述15種植物的韌皮部蛋白質(zhì)或相似蛋白質(zhì)與六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)進(jìn)行同源進(jìn)化比對(duì)，構(gòu)建同源進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果(圖5)顯示，在進(jìn)化關(guān)系上，六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)Ag-PP2-2與石蒜科的忽地笑和葫蘆科南瓜屬的南瓜和筍瓜的韌皮部蛋白質(zhì)在同一個(gè)大的進(jìn)化分支上，并且與忽地笑的進(jìn)化關(guān)系最近。禾本科的二穗短柄草、烏拉爾圖小麥、粳稻、玉米和粟同屬于一個(gè)進(jìn)化分支，但在進(jìn)化關(guān)系上與3種芹菜較遠(yuǎn)。中國(guó)本地芹菜品種六合黃心芹、津南實(shí)芹的Ag-PP2-2進(jìn)化上歸為一組，與美國(guó)來(lái)源的美國(guó)西芹在進(jìn)化上有一定的距離。

圖5 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2和部分物種的韌皮部蛋白質(zhì)以及相似蛋白質(zhì)氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of the AgPP2-2 and the similar proteins from celery and higher plants based on amino acid sequences

2.4 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的理化性質(zhì)分析

對(duì)芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2和上述植物中的韌皮部蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸組成及理化性質(zhì)分析，結(jié)果(表1)顯示，六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2氨基酸組成及理化性質(zhì)差異較小，而它們與其他物種的韌皮部蛋白質(zhì)及類(lèi)似蛋白質(zhì)的氨基酸組成及理化性質(zhì)有較大差異。這些植物中的韌皮部蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)較多，且變化幅度較大。其中，大豆中韌皮部蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)最多，為412個(gè);忽地笑韌皮部蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)最少，為171個(gè)。理論分子量差異也比較大(2.0×104～4.7×104)，大豆韌皮部蛋白質(zhì)理論分子量最高(47 105.7)，六合黃心芹韌皮部蛋白質(zhì) AgPP2-2理論分子量最低(19 737.5)。酸性氨基酸比例要略高于堿性氨基酸比例，不溶蛋白質(zhì)比例為62.9% ～89.7%;理論等電點(diǎn)變化也較大，既有堿性蛋白質(zhì)又有酸性蛋白質(zhì);總平均疏水指數(shù)為－0.192～ －0.640，其中桃的疏水性最強(qiáng)，筍瓜的疏水性最弱。

對(duì)本試驗(yàn)克隆的六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性分析。結(jié)果(圖6)表明:在3種芹菜中，該蛋白質(zhì)的第120賴(lài)氨酸和121位谷氨酸親水性最強(qiáng)，其次親水性強(qiáng)的位點(diǎn)分別出現(xiàn)在第29位亮氨酸和第129位天冬酰胺;第92位纈氨酸疏水性最強(qiáng)，其次疏水性強(qiáng)的位點(diǎn)分別出現(xiàn)在第11位亮氨酸和第176位纈氨酸?？傮w而言，3種芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因的大部分氨基酸都是疏水性氨基酸，都屬于疏水性蛋白質(zhì)。

2.5 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

用DNAMAN軟件對(duì)3種芹菜的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，結(jié)果表明，六合黃心芹韌皮部蛋白質(zhì)由54.2%的卷曲結(jié)構(gòu)、36.3%的折疊結(jié)構(gòu)和9.5%的螺旋結(jié)構(gòu)組成(圖7)，津南實(shí)芹韌皮部蛋白質(zhì)由55.6%的卷曲結(jié)構(gòu)、32.0%的折疊結(jié)構(gòu)和12.4%的螺旋結(jié)構(gòu)組成，美國(guó)西芹韌皮部蛋白質(zhì)由54.8%的卷曲結(jié)構(gòu)、35.8%的折疊結(jié)構(gòu)和9.4%的螺旋結(jié)構(gòu)組成?？傮w而言，3種芹菜韌皮部蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，其中卷曲和折疊結(jié)構(gòu)都是主要組成部分。

2.6 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)基因AgPP2-2不同組織和不同逆境處理的表達(dá)分析

通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)基因AgPP2-2在3種芹菜不同組織中的表達(dá)情況(圖8)。AgPP2-2基因在3種芹菜的根、莖、葉和花中均有表達(dá)，呈現(xiàn)較明顯的組織特異性。其中，AgPP2-2基因在津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的莖中相對(duì)表達(dá)量最高，在根和葉中相對(duì)表達(dá)量較低，在花中相對(duì)表達(dá)量最低;而在六合黃心芹中，根、莖和花中表達(dá)差異較小，在葉中的表達(dá)最低。AgPP2-2基因的表達(dá)與韌皮部組織分布呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，莖中韌皮部的分布相對(duì)較多，因此莖中韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因的相對(duì)表達(dá)量較高。在莖中，津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的相對(duì)表達(dá)量較高，其中津南實(shí)芹的相對(duì)表達(dá)量最高，這可能與津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的植株高大，而六合黃心芹的植株相對(duì)較矮有關(guān);在根和葉中，美國(guó)西芹的相對(duì)表達(dá)量最高，六合黃心芹和津南實(shí)芹的相對(duì)表達(dá)量較低;在花中，六合黃心芹的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較高，津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的相對(duì)表達(dá)量很低。

圖6 芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2氨基酸序列親水性和疏水性比較Fig.6 Predicted hydrophilicity and hydrophobicity of amino acid sequence of phloem protein AgPP2-2 from celery

圖7 六合黃心芹韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Secondary structure of phloem protein AgPP2-2 from celery Liuhehuangxinqin

分別對(duì)六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹進(jìn)行20%PEG處理、200 mmol/L NaCl處理、4℃低溫處理、38℃高溫處理2 h，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)不同芹菜韌皮部蛋白質(zhì)基因AgPP2-2在干旱、高鹽、低溫和高溫處理下的表達(dá)情況(圖8)。3種芹菜的AgPP2-2基因在干旱、高鹽、低溫和高溫4種不同逆境處理下的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照均表現(xiàn)為不同程度的下降。其中干旱和高溫處理后的相對(duì)表達(dá)量下降幅度最顯著，高鹽和低溫處理后的相對(duì)表達(dá)量也有不同程度的下降。從3種芹菜中4種不同逆境處理后AgPP2-2基因表達(dá)分析結(jié)果來(lái)看，高溫脅迫對(duì)Ag-PP2-2基因的表達(dá)抑制大于低溫脅迫，干旱脅迫對(duì)AgPP2-2基因的表達(dá)抑制大于鹽脅迫。不同芹菜材料逆境脅迫后AgPP2-2基因表達(dá)也表現(xiàn)為明顯的差異，南京地區(qū)的本芹六合黃心芹在高溫處理后AgPP2-2基因下降幅度接近一半，而在形態(tài)較為接近但地域來(lái)源不同的津南實(shí)芹和美國(guó)西芹中基本檢測(cè)不到AgPP2-2基因的表達(dá)。干旱處理后，津南實(shí)芹的表達(dá)量卻大大高于美國(guó)西芹。

圖8 芹菜中AgPP2-2基因在不同組織(A)及逆境脅迫(B)中的表達(dá)水平Fig.8 Expression level of phloem protein gene AgPP2-2 in different tissues(A)and adversities(B)of celery

3 討論

本研究的試驗(yàn)材料中六合黃心芹和津南實(shí)芹是中國(guó)的地方品種，美國(guó)西芹來(lái)源于美國(guó)，三者具有比較大的地域差異，在外形上也具有一定的差異性。對(duì)3種芹菜韌皮部蛋白質(zhì)基因AgPP2-2核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行多重分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)芹菜品種在核苷酸水平上有4個(gè)堿基的差異，編碼的氨基酸有3個(gè)位點(diǎn)的差異，說(shuō)明在3種芹菜中韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2相對(duì)較為保守。地域變化、外界環(huán)境的改變和人工選育雖然導(dǎo)致了3種芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2在核苷酸和氨基酸水平上的差異，而較小的差異變化可能與韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2在芹菜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所具有的特定生理功能有關(guān)。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，六合黃心芹、津南實(shí)芹和美國(guó)西芹的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2與石蒜科的忽地笑進(jìn)化關(guān)系最近，與忽地笑和葫蘆科的南瓜和筍瓜韌皮部蛋白質(zhì)在同一個(gè)大的進(jìn)化分支上。禾本科的二穗短柄草、烏拉爾圖小麥、水稻、玉米和粟的韌皮部蛋白質(zhì)處于同一分支，同樣薔薇科的野草莓與桃來(lái)自于同一分支，但是傘形科、石蒜科、葫蘆科、禾本科、十字花科、豆科、茄科、薔薇科和楊柳科的各種植物的韌皮部蛋白質(zhì)及相似蛋白質(zhì)都分屬于不同的分支，說(shuō)明不同物種的韌皮部蛋白質(zhì)或相似蛋白質(zhì)的進(jìn)化都呈現(xiàn)一定的種屬特性，這為傘形科植物的進(jìn)化研究提供了可靠的理論依據(jù)。芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2保守性很高，它們?cè)诎被釟埢鶖?shù)、理論分子量、理論等電點(diǎn)、堿性氨基酸比例、酸性氨基酸比例、不溶蛋白質(zhì)比例、親水性/疏水性以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)組成等各方面都保持高度一致，具有 PP2 超家族保守結(jié)構(gòu)域［12，20，21］。芹菜韌皮部蛋白質(zhì)可能在芹菜生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中起重要作用，導(dǎo)致該基因進(jìn)化保守程度較高。

高等植物中，韌皮部蛋白質(zhì)在物質(zhì)運(yùn)輸、維持植物形態(tài)、抵御外界傷害等方面起著重要作用。芹菜韌皮部蛋白質(zhì)基因AgPP2-2在3種芹菜不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，AgPP2-2基因在津南實(shí)芹和美國(guó)西芹莖中相對(duì)表達(dá)量最高，根和葉中相對(duì)表達(dá)量較低，在花中相對(duì)表達(dá)量最低，與芹菜 AgPP2-1基因表達(dá)結(jié)果相吻合［22］，說(shuō)明AgPP2-2基因的表達(dá)與韌皮部組織分布呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。但是，在南京本芹品種六合黃心芹中呈現(xiàn)出在根、莖、葉和花中表達(dá)差異相對(duì)較小，葉中的表達(dá)量最低，不同的芹菜之間也呈現(xiàn)表達(dá)的差異。植物中韌皮部蛋白質(zhì)主要與植物的物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)，植物在遭受不同逆境處理后，植物本身處于一種防御的狀態(tài)，相應(yīng)的新陳代謝速率可能會(huì)有所降低，其物質(zhì)運(yùn)輸會(huì)受到影響。本研究發(fā)現(xiàn)，不同逆境處理后，3種芹菜的韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因相對(duì)表達(dá)量都有不同程度的下降，可能與此相關(guān)。另外，芹菜中AgPP2-2基因高溫處理后的表達(dá)量變化大于低溫處理下的表達(dá)量變化，干旱處理后的表達(dá)量變化大于鹽處理后的表達(dá)量變化，不同芹菜品種之間也呈現(xiàn)較大的差異。植物的一生經(jīng)常會(huì)遇到干旱、高鹽、低溫和高溫等不良環(huán)境條件的影響，導(dǎo)致植物水分虧缺，產(chǎn)生滲透脅迫，嚴(yán)重影響到植物的生長(zhǎng)發(fā)育，植物具備一定的逆境適應(yīng)性［23-24］。植物的逆境脅迫調(diào)控是復(fù)雜的過(guò)程，涉及到調(diào)控基因和功能基因等等，韌皮部蛋白質(zhì)參與植物各類(lèi)物質(zhì)的運(yùn)輸，對(duì)植物抗逆響應(yīng)起到重要的作用［25-27］。本研究對(duì)3種芹菜韌皮部蛋白質(zhì) Ag-PP2-2基因的克隆與分析對(duì)于進(jìn)一步分析芹菜相對(duì)不耐高溫、抗凍性較強(qiáng)等生物學(xué)特性具有較為重要的意義。

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